Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Температура. Влияние температуры (Т) на скорость (у) обычных химических реакций описывается зависимостью Аррениуса:
In г’= In v0—EjRT. , (4.1)
В случае ферментов температурные зависимости скорости имеют более #;ложйый вид, что обусловлено как термолабйльностью белковых глобул, так и влиянием температуры на Константы
Михаэлиса, константы скоростей распада отдельных фермент-субстратных комплексов и положение pH-оптимума. В области низких температур, когда структура активного центра достаточно стабильна, константа скорости распада фермент-субстратного комплекса описывается уравнением типа Аррениуса. Срёднее значение эффективной энергии активации для ферментативных процессов обычно близко к 40 кДж/моль. Как правило, зависимость скорости ферментативных реакций имеет температурной оптимум, обусловленный тепловой денатурацией фермента.
Буфер и pH. Все ферменты характеризуются определенным pH-оптимумом активности. Этот диапазон максимальной активности может иметь весьма узкий интервал. pH-Оптимум активности зависит от ионной силы, вида используемого буфера и меняется с температурой. Например, для щелочной фосфатазы рН-оптимум при температурах 37, 30 и 25°С составляет 9,9; 10,1 и 10,3 соответственно.
Субстраты. Определяемая каталитическая активность фермента сильно зависит от используемого субстрата. Субстраты данного фермента могут быть как природными, так и синтетическими, при этом скорости их превращения также значительно варьируют. Например, фермент р-?>-галактозидаза гидролизует синтетические субстраты 2-нитрофенил-р-?)-галактозид и 4-нитрофенил-р-1)-га-лактозид' соответственно в 7 и 17 раз быстрее, чем естественный субстрат лактозу.
Эффекторы. К эффекторам относят как ингибиторы, так и активаторы ферментативных реакций, т. е. вещества, оказывающие замедляющее или ускоряющее действие на превращение субстрата. Эффекторы могут вноситься в реакционную среду как с растворами реагента, так и анализируемого обра'зца.. В некоторых случаях для ферментативных реакций наблюдается ингибирование высокими концентрациями субстрата или одним из продуктов реакции. Наличие в реакционной среде эффекторов может приводить к нежелательному отклонению от линейной зависимости наблюдаемой скорости ферментативной реакции от количества фермента в системе.
Экспериментальные методы определения ферментативной активности. В иммуноферментном анализе наибольшее распространение получил фотометрический метод регистрации активности ферментов. В качестве субстратов ферментов при этом используют такие вещества, продукты превращения которых являются окрашенными соединениями или, наоборот, окраска самих субстратов изменяется в процессе реакции.
. Окрашенные соединения поглощают видимый свет, т. е. электромагнитное излучение с длинами волн 400—700 нм. При прохождении пучка света через кювету раствора толщиной d (см) интенсивности прошедшего света / по сравнению с начальной интенсивностью /о связана законом Бугера—Ламберта-^Бера:
/=/0-Ю-,л?, где е — постоянная для данного вещества в определенном растворе величина, называемая молярным коэффициентом поглощения (размерность {моль-1-л-см-1]); С — концентрация вещества, поглощающего свет (моль/л). На практике часто измеряют оптическую плотность (А), которая связана с I и /о следующим простым соотношением;
•A=lg-y-. (4.2)
Таким образом, если поглощение света подчиняется закону Бугера—Ламберта—Бера, то оптическая плотность раствора в определенном диапазоне прямо пропорциональна концентрации вещества.
В последнее время в иммуноферментном анализе получили распространение субстраты, которые образуют продукты, регистрируемые флуориметрическим методом. Молекула при поглощении фотона переходит из основного электронного состояния в возбужденное. Возбужденная молекула может вернуться в основное состояние, при этом избыток энергии перейдет в теплоту, но может произойти обратный процесс перехода электрона на основной уровень, сопровождающийся выделением кванта света, который носит название флуоресценции. Благодаря частичной потере энергии при переходе молекулы из возбужденного состояния в основное длина волны испускаемого света всегда больше длины волны поглощаемого света. Как отмечалось выше, оптическая плотность раствора определяется следующим соотношением:
A=edC=lg Jj-. (4.3)
Долю молекул, перешедших из возбужденного состояния в основное с испусканием света, определяет квантовый выход <р. При условии, что г4С<. 0,1, предыдущее уравнение принимает вид
-°^7 ^2,Жй. (4.4)
Интенсивность флуоресценции (F) пропорциональна. количеству света, адсорбированного образцом (/0-=—/), н так как /•— /0, можно записать, что
F^2,3sI0<fCd- (4.5)
Таким образом, интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества С н абсолютному значению начальной интенсивности света /о, в то время как в фотометрии сравниваются относительные интенсивности / и /о. Этот факт позволяет на 1—2 порядка повысить чувствительность определения вещества в растворе флуориметрическим методом по сравнению с фотометрическим.
