Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
мг/мл. Помещают навеску рифампицина в стерильную стандартную пробирку,
добавляют метанол, закрывают пробирку и встряхивают. Хранят до 3 мес при
-20°С.
- Тетрациклин (Тс) (Sigm): Растворяют в концентрации
10 мг/мл в дистиллированной Н2О и стерилизуют фильтрованием. Хранят
до 1 мес при 4°С или в замороженном виде (-20 °С).
- Гигромицин (Hm) (Sigma): растворяют и хранят так же, как канамицин. .
- Нистатин (Ny) Sigma); растворяют в метаноле в концентрации 10 мг/мл
непосредственно перед использованием, т. к. нистатин нестабилен при
хранении исходных растворов.
Все антибиотики можно добавлять непосредственно в жидкую среду перед
использованием или в расплавленную агаризо-
ванную среду, охлажденную до 45-55 °С.
Приложение 2 [IV]
Подготовка эксплантатов для инокуляции агробактериями
А. Эксплантаты стерильных проростков
1. Стерилизуют поверхность семян в 10%-ном (вес на объем) растворе
коммерческого отбеливателя (гипохлорита натрия) при конечной концентрации
активного хлора около 1°/о-Время стерилизации зависит от вида растения,
но обычно составляет 10-30 мин. Если у семян плотная восковая оболочка
или сильно опушенная и неровная поверхность, стерилизация достигается их
предварительным ополаскиванием в 70%-ном этаноле в течение 5-10 с.
2. Промывают семена 5 раз стерильной водопроводной водой. Если семена
очень маленькие, то удобно стерилизовать и отмывать их в стерильной
найлоновой сетке либо в найлоно-вом или стальном нержавеющем сите
(например, чайном ситечке).
3. Проращивают семена на MSO-среде (приложение 2[II]), содержащей 0,8%
агара, в подходящем культуральном сосуде.
Трансформация клеток двудольных растений
177
Инкубируют при 25 °С (4000 люкс) и подращивают проростки до
необходимого размера. Можно прорастить стерилизованные семена и в
вермикулите, смоченном раствором Хоглаида (приложение 2 [II]).
4. Для получения требуемых эксплантатов растения нарезают на стерильной
белой керамической плитке.
Б. Эксплантаты тепличных растений
1. Тщательно моют щеткой запасающие органы, срезают молодые побеги,
листья или ткани цветка у выращенных в теплице растений и стерилизуют их
поверхность 10%-ным коммерческим отбеливателем (вес на объем) в течение
20- 30 мин. Крупные эксплантаты удобно стерилизовать в больших плоских
сосудах из пирекса; небольшие эксплантаты - в меньших стерильных сосудах
или стандартных пробирках.
2. Ополаскивают ткани в 5 сменах стерильной водопроводной воды.
3. Используя стерильную белую кафельную плитку или большую чашку Петри,
удаляют все поврежденные отбеливателем участки растений с помощью
стерильного скальпеля, как описано ниже.
Большие эксплантаты
1. Побеги: срезают крупные базальные листья, и разрезают на кусочки
длиной 4 см (или более, если кусочек помещается в сосуде для
культивирования). Длинные отрезки черешков можно получить аналогичным
способом.
2. Запасающие органы: нарезают на части удобного размера и затем вырезают
диски толщиной 0,3-0,5 см и диаметром 1-2 см.
3. Помещают диски на RS-среду (25 мл в чашке Петри диаметром 9 см) и
втыкают побеги основанием вниз в твердую агаризованную среду MSO (состав
сред см. в приложении 2[П]).
Небольшие эксплантаты
Листовые диски, небольшие срезы тканей цветка, стебля или черешки
следует приготовлять осторожно, стараясь не сминать, и как можно быстрее
помещать в соответствующую жидкую среду (как правило, MSD4X2), чтобы
избежать высыхания. Размер эксплантатов может варьировать в диапазоне 2-
10 мм2.
В. Эксплантаты размножаемых растений
Размножение растений - это удобный путь получения однородных партий
стерильных, генетически идентичных культур и
178
Глава 2
побегов для экспериментов по трансформации. Получение растительного
материала путем размножения in vitro имеет то преимущество, что для этого
не требуется теплица. Кроме того, растения избегают контакта с насекомыми
и микроскопическими вредителями. Однако данная методика требует больших
усилий, чем проращивание стерильных семян in vitro или стерилизация
эксплантатов из выращенных в теплице побегов. Размножаемые in vitro
растения очень редко цветут и их нельзя считать физиологически
нормальными. Технология размножения in vitro зависит от конкретного вида
растения, более подробные сведения можно найти в литературе [19, 42, 43].
В большинстве методов для размножения двудольных растений используют
эксплантаты пазушных почек. Методика размножения в случае табака и льна
изложена соответственно в разд. 2.4.3 и 2.5.3.2. Эксплантаты из
размножаемых in vitro растений можно получить, как описано выше, для
побегов в разд. А и Б.
Приложение 2 [V]
Растворы для выделения протопластов табака
A. CPW соли
Компонент Исходный раствор (Х100) Концентрация (мг/л)
(мг/л)
Раствор 1
КН2Р04 2 720,00 27,200
KN03 10 100,00 101,000
