Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
MgS04-5H20 24 600,00 246,000
KI 16,00 0,160
CuS04-5H20 2,50 0,025
Раствор 2
СаС12-2Н20 148 000,00 1 480,000
Исходные растворы можно хранить при 4°С несколько месяцев.
CPW13M: соли CPW с добавлением 13% (вес на объем) манни-тола (130 г/л).
CPW9М: соли CPW с добавлением 9% (вес на объем) манни-тола (90 г/л).
CPW21S: соли CPW с добавлением 21% (вес на объем) сахарозы (210 г/л).
Доводят pH среды до 5,8 и стерилизуют автоклавированием.
Трансформация клеток двудольных растений
179
Б. Растворы ферментов для выделения из листьев мезофильных
протопластов табака
Целлюлаза "Onozuka" R10 0,2% (вес на объем)
Мацерозим R10 0,5% (вес на объем)
Эти ферменты можно приобрести через фирму R. W. Unwin Ltd.
Растворяют оба фермента в CPW13M, стерилизуют фильтрованием через
мембрану с размером пор 0,45 мкм и затем хранят при -20 °С.
Приложение 2 [VI]
Выделение протопластов из измельченных кусочков листа
1. Стерилизуют поверхность листьев тепличных растений табака или срезают
листья с размножаемых in vitro растений. Стараются использовать молодые
листья, которые вот-вот полностью распустятся.
2. Помещают один лист на стерильную белую кафельную плитку и с помощью
скальпеля удаляют среднюю и боковые жилки. Складывают полоски листовых
пластинок в удобные стопки и нарезают как можно мельче.
•3. Равномерно распределяют измельченные листья по двум чашкам Петри
(диаметр 9 см), содержащим 20 мл среды CPW 13М (приложение 2[V]).
Стараются, чтобы материал был хорошо увлажнен.
4. С помощью стерильного шприца на 60 мл отбирают среду и заменяют ее на
10 мл смеси ферментов (0,2% целлюлазы~Ь + 0,1% мацерозима в CPW13M).
5. Инкубируют в течение ночи при 25 °С в темноте.
6. Осторожно встряхивают переваренные кусочки листа в смеси ферментов
для высвобождения протопластов и переносят содержимое чашки в другую,
аналогичную первой. При этом суспензию пропускают через сито с размером
пор 64 мкм, чтобы удалить крупные агрегаты дебриса.
7. С помощью пастеровской пипетки переносят суспензию протопластов в две
центрифужные пробирки Sarstedt с завинчивающимися крышками,
центрифугируют 10 мин при 400 об/ /мин в центрифуге MSE Centaur 2 (или
эквивалентной) и затем обрабатывают протопласты, как описано в разд.
2.7.3, стадии 8-12).
280
Глава 2
Приложение 2 [VII]
Методы флуоресцентного окрашивания для контроля
развития растительных протопластов
A, Визуализация регенерации клеточной стенки с помощью тинопала
1. Готовят насыщенный раствор тинопала (Tinopal, Ciba Geigy) в
дистиллированной воде. Хранят в темноте при 4°С.
2. Не взбалтывая нерастворившийся материал, добавляют
0,1 мл насыщенного раствора тинопала к 20 мл CPW9M (приложение 2[V]) и
перемешивают. Этот раствор можно стерилизовать фильтрованием и хранить в
холодильнике в Течение нескольких месяцев.
3. Смешивают одну каплю тинопала в среде CPW 9М с одной каплей суспензии
протопластов на чистом предметном стекле и накрывают покровным стеклом,
затем оставляют на 5 мин при комнатной температуре.
4. Препарат исследуют под микроскопом, снабженным флуоресцентной
приставкой с фильтром для возбуждения в области 330-380 нм.
Б. Вивуализация ядер с помощью акридинового оранжевого
1. Готовят краситель акридиновый оранжевый, растворяя 10 мг акридинового
оранжевого (Sigma) в 4 мл 50 мМ глицин-NaOH буфера, pH 8,5 и смешивают с
6 мл CPW 13М. Хранят в темноте при 4°С.
2. Добавляют одну каплю раствора акридинового оранжевого к 3 мл суспензии
протопластов и инкубируют в темноте 15 мин при комнатной температуре.
3. Для уменьшения фона отмывают протопласты центрифугированием при 100g в
течение 5 мин и ресуспендируют осадок в среде CPW 9М. Повторяют дважды.
4. Наблюдают с помощью УФ-микроскопа, как описано выше в разд. А,
используя голубой фильтр возбуждения флуоресценции.
B. Определение выживаемости клеток с помощью диацетата флуоресцеина
1. Готовят исходный раствор диацетата флуоресцеина (Sigma) в ацетоне в
концентрации 5 мг/мл. Хранят при -20 °С.
2. Готовят 0,01%-ный раствор диацетата флуоресцеина в MSP1 9М (приложение
2 [II]).
3. Осаждают клетки или протопласты и ресуспендируют в растворе красителя.
Оставляют на 5 мин при комнатной температуре, а затем наблюдают с помощью
УФ-микроскопа, используя голубой фильтр.
Приложение 2 [VI11]
Примеры процедур генетической трансформации растений, основанных на
системе переноса генов агробактерий
____
Виды Эксплантат1) Vir-tlOMOmnllK
Маркерный Метод регенерации побегов и ком
(Число сортов) и вектор
ген ментарии
Виды Solanaceous Листовые диски (T). pTiB6S3SE::pMDN200 Km
Прямая регенерация---(1---20)/экс-
