Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
препаратах кофермента [2333]; позднее было установлено, что этот изомер
является артефактом, образующимся из природного NAD при 100° в процессе
выделения [2184]. Было показано, что в данном
f изомере связь с никотинамидом имет a-конфигурацию (поэтому он
оказывается неактивным в опытах с дегидрогеназами), в то время как в
природном активном изомере рассматриваемая у связь имеет p-конфигурацию.
Полный синтез NAD был осуще-ствлен Хьюзом, Кеннером и Тоддом [2082].
Методы синтеза "*( нуклеотидных коферментов рассмотрены в обзоре Бэддилея
и •• Хьюза [224]. Поскольку NADPH можно превратить в NADH путем удаления
одной фосфатной группы щелочной фосфатазой [3350], структуры коферментов
(учитывая, конечно, добавочный " фосфат у NADPH) идентичны.
v Восстановление. Коферменты легко восстанавливаются хи-^ мическими
восстановителями, например гидросульфитом (отно-
(r) 18-14
я
"66
Глава 9
Рис. 9.2. Спектры поглощения окисленной (/) и восстановленной (//) форм
NAD и NADP.
сительно медленно), а также ферментативным путем (значительно быстрее) -
с участием тех дегидрогеназ, по отношению к которым они специфичны; в
обоих случаях образуется одна и та же восстановленная форма. На
восстановление каждой молекулы расходуется два эквивалента водорода.
Варбург и Христиан установили, что восстановлению подвергается никотин-
амидное кольцо. При восстановлении коферментов изменяется спектр их
поглощения в ультрафиолетовой области: окисленная форма имеет полосу
поглощения только при 260 нм, что обусловлено наличием пуринового и
пиридинового колец, а восстановленная форма - еще и полосу поглощения при
340 нм (рис. 9.2). Эта вторая полоса связана с наличием хиноидной
структуры восстановленного никотинамидного кольца. Такая же полоса
характерна и для простых производных никотинамида (например, иодметилата
никотинамида) в восстановленном состоянии. Нуклеотиды, не содержащие
никотинамида, в этой области не поглощают.
Дальнейшее доказательство того, что в дегидрогеназной реакции
восстанавливается именно никотинамидное кольцо, Варбург и Христиан
получили следующим образом. При восстановлении коферментов водородом в
присутствии платинового катализатора поглощается не два, а шесть
эквивалентов водорода и пиридиновое кольцо восстанавливается до
пиперидинового, причем в результате образуется продукт, не способный
принимать участие в ферментативной реакции и не поглощающий при 340 нм.
Если кофермент вначале восстанавливается дегидрогеназой (с поглощением
двух эквивалентов водорода), а затем водородом в присутствии Pt, то в
последней реакции поглощается не шесть, а четыре эквивалента водорода.
Это свидетельствует о том, что два эквивалента водорода, присоединившихся
Кофакторы ферментов
66 Т
при действии фермента, включаются в те же положения, что и два атома из
шести атомов водорода, присоединяющихся при восстановлении окисленной
формы водородом в присутствии Pt. Если бы они присоединились к любой
другой части молекулы, то во второй стадии восстановления потребовалось
бы еще шесть эквивалентов водорода. Естественно допустить, что при
ферментативной реакции гидрируется одна двойная связь; это должно
приводить к образованию структуры с распределением связей, похожим на
распределение связей в о-хиноне, и обусловливать появление полосы
поглощения при 340 нм. Одно время полагали (по аналогии с химическими
свойствами других пиридиновых соединений), что восстанавливается двойная
связь, находящаяся около атома азота, в результате присоединения атома
водорода к атому углерода 2 или 6. Однако в 1954 г. опыты с применением
дейтериевой метки показали, что это предположение неправильно. В гл. 7 мы
ссылались на работу Венесланда и др., в которой показано, что при
ферментативном восстановлении NAD+ дейтерированными субстратами атом
дейтерия включается всегда в одно определенное положение никотинамидного
кольца. Химическими методами удалось определить положение этого атома
дейтерия и таким образом, установить строение восстановленной формы
кофермента.
В результате весьма остроумных экспериментов Пулмен и др. [3763]
показали, что дейтерий, переносимый на кофермент при восстановлении
дегидрогеназой, не включается в положение 2 или 6 пиридинового кольца.
Его истинное положение было установлено Левусом, Венесландом и Харрисом
[2853]. Чистохимическим путем они синтезировали три никотинамида, каждый
из которых содержал атом дейтерия, связанный с атомом углерода в
положении соответственно 2, 4 или 6. Каждый из трех меченых никотинамидов
был включен в молекулу NAD+ путем ферментативного замещения с
использованием NAD(P)+-нуклеозидазы (КФ 3.2.2.6); таким способом были
получены препараты окисленного кофермента, меченного в трех различных
положениях. Эти препараты были затем подвергнуты восстановлению
гидросульфитом в Н20. Поскольку атом углерода, по которому происходит
восстановление, несет по одному атому водорода и дейтерия и является,
