Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
следовательно, изотопно асимметричным, то образуется смесь двух
стереоизомеров
(принимая во внимание, что восстановление гидросульфитом не является в
заметной степени стереохимически специфичным), в одном из которых
дейтерий находится перед плоскостью кольца, а в другом - позади нее.
Стороны кольца не являются эк-
"68
Глава 9
вивалентными, поскольку в 3-м положении находится амидная группа.
После окисления каждого из этих трех препаратов NADH пировиноградной
кислотой в присутствии лактатдегидрогеназы выделили образовавшийся лактат
и определили в нем содержание дейтерия. Оказалось, что из положений 2 и 6
дейтерий совсем не переносится, а из положения 4 он переносится в
количестве, близком к теоретическому. Это убедительно доказывает, что в
дегидрогеназных реакциях положения 2 и 6 не затрагиваются и что
восстановление происходит исключительно в положениях 1 и 4.
Восстановление может быть представлено, как показано ниже, где 2 Н
обозначают два восстановительных эквивалента (часто это два атома
водорода молекулы субстрата дегидрогеназы).
V Н\ ,/-Н
У/\ /°\
НС С-СО.Ш, НС с--со,кн2
I )| +2Н^ I! 2
НС сн НС сн
4 х
N N
I 1
R, " R +Н+
NAD NADH
Адекватность этой структуры была подтверждена также в результате
спектроскопических исследований в инфракрасной области и методом ЯМР
путем сравнительного изучения 2-, 4- и
6-дейтерированных никотинамидов [584, 2101].
Дальнейшее подтверждение переноса водорода в положение 4 было получено с
помощью рентгеноструктурного анализа при установлении трехмерной
структуры комплекса дегидрогеназы и субстрата [37]. Было найдено, что
реактанты располагаются в активном центре фермента таким образом, что
атом водорода субстрата, который переносится на NAD, направлен к 4-му
углеродному атому пиридинового кольца и находится в непосредственной
близости от него.
Восстановление кольца по связи 1,4 характерно не только для
ферментативных реакций. Выше было отмечено, что такого же типа
восстановление осуществляется гидросульфитом. Этот тип восстановления не
является, однако, характерным для пиридиновых соединений - он связан с
наличием СО-грушш в боковой цепи.
При переходе кофермента из окисленной формы в восстановленную происходит
присоединение одного атома водорода и потеря одного положительного
заряда. В связи с этим окисленную форму сокращенно обозначают NAD+, а
восстановленную -
Кофакторы ферментов
669
NADH; в действительности, однако, в нейтральной среде обе -формы заряжены
отрицательно и переход следует записать как NAD'-"-NADH2- или NADP2--
HMADPH3-, поскольку фосфатные группы несут отрицательные заряды. Обычно,
однако, зарядом фосфатных групп пренебрегают и учитывают только заряд
никотинамидной части. Если, говоря о коферменте, не уточняют, о какой
форме его идет речь - окисленной или восстановленной, то используют
обозначение NAD.
Теми названиями, которые были предложены еще в то время, когда структура
соответствующих форм не была полностью установлена -
дифосфопиридиннуклеотид (DPN) для NAD, трифосфопиридиннуклеотид (TPN) для
NADP и дигидро-DPN или дигпдро-TPN для восстановленных форм - в настоящее
время не пользуются. Обозначение же NAD официально признано и
используется в номенклатуре [1265, 1266].
Механизм биологических окислительно-восстановительных реакций уже
обсуждался в гл. 7, однако на ряде моментов, связанных с восстановлением
рассматриваемых коферментов дегидрогеназами, следует остановиться
дополнительно. При восстановлении NAD+ на него переносится один атом
водорода и один электрон; поскольку в итоге происходит присоединение
гидридного иона, то реакцию иногда называют переносом гид-ридного иона.
Из этого, конечно, не следует, что эти компоненты переносятся в составе
одной частицы; сформулировать механизм на основании уравнения полной
реакции не представляется возможным. Рассматривая реакцию "со стороны
субстрата", можно отметить, что во многих дегидрогеназных реакциях от
субстрата отщепляются два атома водорода; например, -СНОН-группа
субстрата обычно превращается в -СО-груп-пу. Следовательно, нельзя
говорить о простом переносе гидрид-ного иона от субстрата к NAD+.
Рис. 9.3. Предполагаемая схема связывания субстрата в активном тройном
комплексе [37].
У V, H2N . _ Г ¦ о Arg-109
X
.NH
•Н
NH
Arg-171
670
Глава 9
Определенные сведения о механизме процесса были получены в результате
рентгеноструктурных исследований комплекса субстрат - дегидрогеназа - NAD
для лактатдегидрогеназы из тканей акулы (хотя данные не вполне
однозначны) :[37]. Установлено, что карбоксильная группа лактата
взаимодействует с остатком аргинина; в результате лактат удерживается в
активном центре в таком положении, что Н от СН переносится к С-4
никотинамидного кольца (которое расположено достаточно близко), в то же
время Н от ОН переносится в виде протона на расположенную рядом
гистидиновую группу фермента; последняя функционирует как "ловушка
протона". "Кофермент теряет свой заряд, который передается через субстрат
