Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
имеет кодовый номер 2.7.2.5. -Прим. ред.
Ингибирование и активация ферментов
653
Отсутствие поправок на "холостые скорости"
Предположим, что в отсутствие фермента регистрируется некоторая скорость
(или кажущаяся скорость) реакции и она не вычитается из скорости,
полученной в присутствии фермента. В таком случае результаты кинетических
измерений могут быть ошибочно объяснены наличием отрицательной
кооперативности. Если эта "холостая скорость" постоянна в используемом
интервале концентраций субстрата, зависимость скорости от концентрации
субстрата не будет проходить через начало координат. Тогда в двойных
обратных координатах будут получаться выпуклые кривые, стремящиеся к
величине 1/холостая скорость, а не к бесконечности при увеличении
обратной концентрации субстрата. Нелинейность зависимости в двойных
обратных координатах становится очевидной, если ввести в уравнение
скорости реакции холостую скорость w в отсутствие фермента. Уравнение
начальной скорости будет иметь вид
V- ~- + ш. (8.409)
После преобразований получаем -
У = ^(^- + т!г)+т!г(2 + ТЯ-) + 4- (8.410)
Характерные кривые в двойных обратных координатах для этого случая
приведены на рис. 8.59, Л.
А
Рис. 8.59. Влияние скорости неферментативной реакции на вид графика в
двойных обратных координатах. А. Влияние постоянной "холостой скорости",
величина которой составляет 2% от V (кривая 1) и 10% от V (кривая II). Б.
Влияние скорости неферментативной реакции, величина которой
пропорциональна s. Кривые рассчитаны по уравнению (8.411) при Км=К=1 и
&'= = 0,1 (кривая I) или 0,5 (кривая II).
654
Глава 8
В работе [1056] рассмотрена более сложная ситуация, когда скорость
реакции в отсутствие фермента пропорциональна концентрации субстрата.
Уравнение начальной скорости реакции в этом случае имеет вид
--------V+*'5' (8.411)
1 + 8
При s->-оо скорость реакции стремится к бесконечности и, таким образом, в
двойных обратных координатах будут наблюдаться выпуклые кривые,
проходящие через начало координат (1/у = 0, когда 1/5 = 0). Это можно
показать, преобразовав уравнение (8.411) к виду
( Y. \±
1 / Км \ 1 . V V + к'Км I S ,о ,,оч
it ( v+к'км')т +-----------------;-г-• <8-412>
k' + (V + k'KM> -
Характерные кривые в двойных обратных координатах для этого случая
приведены на рис. 8.59, Б.
Примеси в растворе фермента
Выпуклые кривые в двойных обратных координатах могут наблюдаться и в том
случае, когда фермент содержит примесь субстрата. Это приводит к
систематическому занижению суммарной концентрации субстрата, находящегося
в реакционной смеси. Обозначим концентрацию субстрата, добавленного в
реакционную смесь, через s, а концентрацию субстрата, присутствующего
в растворе фермента, - через se. Тогда суммарная
концентрация субстрата st равна
st~s_bse (8.413)
и уравнение Михаэлиса-Ментен имеет следующий вид:
v = k~. (8.414)
Так как раствор фермента содержит эндогенный субстрат, концентрация
которого связана с концентрацией фермента соотношением
se = ав, (8.415)
где <о - константа, уравнение (8.414) можно записать как
v=7r^r <8-416>
s -\~(ое
Ингибирование и активация ферментов
655
и преобразовать к виду
1 _ 1 _j Км_
(8.417)
При высоких значениях s это уравнение будет уравнением прямой,
пересекающей ось l/v в точке 1/V. Однако при низких концентрациях
субстрата график в двойных обратных координатах будет представлять собой
выпуклую кривую, асимптотически приближающуюся с ростом 1/s к величине
Этой ситуации также соответствуют нелинейные зависимости начальной
скорости реакции от концентрации фермента, если только концентрация
добавленного субстрата не является очень высокой. Из уравнения (8.416)
следует, что при насыщающих концентрациях субстрата зависимость скорости
реакции от концентрации фермента будет представляться прямой с наклоном,
равным k. При более низких значениях s, но при s^toe линейная зависимость
описывается уравнением и = ?es/(Дм+s). Однако, когда величиной нельзя
пренебречь, будет наблюдаться кривая, начальный наклон которой при очень
низких концентрациях фермента равен ks(Kn+s). При очень высоких значениях
е эта кривая асимптотически приближается к прямой с наклоном, равным k.
Такая кривая и график двойных обратных величин, соответствующий уравнению
(8.417), приведены на рис. 8.60.
Еще один случай, который может приводить к ошибкам при оценке
действительной концентрации субстрата, возможен при наличии в растворе
фермента примеси, необратимо взаимодей-
Д б
Рис. 8.60. Влияние примеси субстрата в растворе фермента на вид графика в
двойных обратных координатах (А) и зависимость начальной скорости реакции
от концентрации фермента (Б).
(8.418)
1/s
е
656
Глава 8
ствующей с субстратом [5057]. В этом случае регистрируемая скорость
реакции будет равна нулю до тех пор, пока мы не добавим достаточное
количество субстрата, превышающее количество имеющегося необратимого
ингибитора. Таким образом, получается кривая Михаэлиса, которая не
