Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
изменяющие активность фермента, происходят достаточно медленно, эти
эффекты наблюдаются на протяжении значительно более длительного периода
времени.
При указанном выше условии простой механизм, представленный схемой
(8.399), может приводить к появлению на кинетической кривой образования
продукта как начального всплеска, так и лаг-периода. Фриден [1422]
рассмотрел такой кинетический механизм (см. рис. 8.54) при следующих
допущениях:
а) стадии связывания субстрата являются быстрыми и при протекании реакции
равновесие на этих стадиях сохраняется;
б) концентрация субстрата остается постоянной на протяжении времени
регистрации; в) реакция является обратимой и г) ингибирование продуктами
реакции отсутствует. При этих допуще-
р
+ 4
Рис. 8.54. Простая система, рассмотренная Фриденом [1422], в которой
может наблюдаться гистерезис.
646
Глава 8
ниях скорость образования продукта равна
(8.401)
где v0 - начальная скорость, Voo - конечная стационарная скорость. В этом
уравнении кажущаяся константа скорости k определяется через константы,
фигурирующие в схеме рис. 8.54, следующим образом:
После интегрирования уравнения (8.401) получаем выражение для
концентрации продукта (р) в любой данный момент времени
При Voo>v0 на кинетической кривой образования продукта наблюдается лаг-
период (рис. 8.53, кривая /), а при ОооС^о - начальный всплеск (кривая
II). Обозначим через т длину отрезка, отсекаемого при экстраполяции
линейного участка кинетической кривой до пересечения с осью времени (см.
рис. 8.53). Эта величина будет связана с кажущейся константой скорости
следующим соотношением:
Фриден [1422] предложил называть ферменты, при функционировании которых
наблюдаются такие медленные изменения скорости реакции, гистерезисными
ферментами и высказал предположение, что эти эффекты могут иметь важное
значение для регуляции метаболических путей, в которых несколько
ферментов конкурируют за один и тот же промежуточный продукт.
Гистерезионые эффекты типа предсказываемого уравнением
(8.403) наблюдаются при функционировании фосфорилазы из мышц лягушки
;[1422].
К гистерезисным эффектам могут приводить также многие более сложные
реакционные механизмы, включающие стадии медленной трансформации [48,
1424, 4361]. В ряде случаев такие эффекты обусловлены медленной
ассоциацией или диссоциацией фермента. Например, в случае a-N-
ацетилгалактозами-нидазы (КФ 3.2.1.49) на кинетической кривой образования
продукта наблюдается лаг-период, если реакция начинается в результате
добавления субстрата к раствору фермента; предполагается, что лаг-период
связан с вызываемой присоединением субстрата медленной ассоциацией менее
активных субъединиц ь более активную олигомерную форму фермента [4977].
Ряд при-
(8.403)
(8.404)
Ингибирование и активация ферментов
647
Рис. 8.55. Кинетические кривые реакции, катализируемой окси-дазой D-
аминокислот (КФ
1.4.3.3), после разбавления исходного раствора холофермен-та [1117].
Изменение концентрации Ог регистрировали с помощью кислородного электрода
в 4 мл пирофосфатного буфера (pH 8,5) при температуре 25 °С. 0,025 мл
(12,5 мкг) раствора фермента, 5,7Х
XI О-2 мкмоль FAD или 20 мкмоль D-аланина были до-бавлецы, как указано в
тексте.
меров таких аллоетерических систем приведен в виде таблицы в работе
Курганова и др. [2661] *. Если лаг-периоды или всплески на кинетических
кривых обусловлены медленной ассоциацией или диссоциацией фермента, то
продолжительность периода, предшествующего установлению стационарной
скорости, будет зависеть от концентрации фермента и, кроме того, от
способа определения активности фермента [2662]. Если, например, фермент
обладает большей активностью в ассоциированной форме и эта форма
преобладает в исходном растворе фермента, то при запуске реакции путем
добавления фермента к раствору субстрата можно ожидать появления
всплесков на кинетической кривой. Разбавление фермента в реакционной
смеси вызывает его диссоциацию и поэтому скорость ферментативной реакции
будет уменьшаться, пока не будет достигнуто новое положение равновесия в
реакции диссоциации олигомерного фермента. С другой стороны, если реакция
запускается добавлением субстрата к уже разбавленному раствору фермента и
субстрат способствует ассоциации, то на кинетической кривой будет
наблюдаться лаг-период, поскольку концентрация олигомерной формы фермента
будет увеличиваться до нового равновесного значения.
Такой эффект был четко показан для окоидазы D-аминокислот (КФ 1.4.3.3) в
работе М. Диксона и Клеппе [1117]. Этот
1 См. также Курганов Б. И. Аллостерические ферменты. - М.: Наука,
1978. гл. IV. - Прим. перев.
648
Глава 8
8
1,4-Ю'5М FAD - -----------
1,4 ¦ 10 s М FAD
7,0- Ю'7М FAD
6,0¦ 10'*M FAD
ч>
¦о
о
О
Рис. 8.56. Кинетические кривые
0 4 8
12 инактивации холофермента после разбавления в присутствии различных
концентраций FAD [1117].
Время, прошедшее с момента разбавления, мин
фермент является флавопротеидом и может быть обозначен как EF, где F -
