Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
проходит через начало координат, а приводит к нулевому значению скорости
при конечном значении концентрации субстрата.
Прочное связывание субстрата
Нелинейные зависимости в двойных обратных координатах могут наблюдаться в
случае некоторых субстратов или активаторов, обладающих высоким сродством
к ферменту (см. с. 181-184); прочно связывающиеся ингибиторы также
приводят к нелинейным зависимостям l/v от концентрации ингибитора (см. с.
518-528). Отклонения от линейности наблюдаются при построении зависимости
скорости от суммарной концентрации, а не от концентрации свободного
вещества, поскольку в рассматриваемых условиях предположение о том, что
количество субстрата в фермент-субстратном комплексе незначительно,
является несправедливым. Такая ситуация возникает при исследованиях в
области относительно высоких концентраций фермента, когда
полная концентрация субстрата (st) может быть
выражена через концентрацию свободного субстрата (Sf) и концентрацию
фермент-субстратного комплекса (х)
st=Sf-\-x, (8.419)
а полная концентрация фермента (et) - через ef - концентрацию свободного
фермента, и х,
et=ef-j-x. (8.420)
Эти уравнения можно использовать для записи условия стационарности по
концентрациям х, et и st в случае простого односубстратного механизма
(4.5) и (4.6):
(st-x)(et-х)-^Смх=0. (8.421)
Решая это уравнение относительно х, получаем 1
Х=2
(s(+et 4~^м) ± V(stJret + ^M)2 4sAj, (8.422)
и начальная скорость реакции будет равна kx.
Это уравнение приводит к нелинейным зависимостям в двойных обратных
координатах, таким, например, как кривая, представленная на рис. 8.61, А.
Эта кривая асимптотически приближается к прямой с наклоном (KtA + et)/V,
которая при зкстрапо-
Ингибирование и активация ферментов
657
А Б
Рис. 8.61. Кинетические кривые при очень высоких концентрациях фермента.
ляции проходит через начало координат. Из уравнения (8.422) следует также
нелинейность зависимости начальной скорости реакции от концентрации
фермента (рис. 8.61,5).
Присутствие двух ферментов, катализирующих одну и ту же реакцию
Этот вопрос рассмотрен в гл. 4 (см. с. 118-121). Кинетическое уравнение
для смеси двух ферментов, имеющих разные /См [уравнение (4.75)],
представляет собой сумму уравнений двух равнобочных гипербол и приводит,
таким образом, к выпуклым кривым на графиках двойных обратных величин
(рис. 4.17). Уравнение (4.75) можно записать в такой же форме, что и
уравнение (8.367), но в данном случае соотношение между отдельными
константами показывает, что график зависимости скорости реакции от
концентрации субстрата должен иметь только один максимум и не иметь точки
перегиба. Такая зависимость может быть ошибочно объяснена наличием
отрицательной кооперативности, поэтому вначале необходимо проверить, не
содержит ли исследуемый препарат двух ферментов. Иногда разграничение
этих двух случаев облегчается, так как при некоторых специальных условиях
более высокая степень полиномов в случае отрицательной кооперативности
приводит к графикам двойных обратных величин, которые имеют четко
выраженную точку излома между двумя линейными участками [963], в то время
как для смеси двух ферментов эти графики имеют вид плавных кривых.
Установить, с чем именно связана кривизна графика, бывает довольно
трудно, поскольку иногда она бывает обусловлена модификацией свойств
части молекул данного фермента в ходе
658
Глава 8
очистки или экстракции, в результате чего образуется смесь форм фермента
с разными свойствами. Такой случай уже обсуждался как одна из причин
наличия реакционной способности только у половины связывающих центров.
Присутствие двух форм фермента, действие каждой из которых описывается
простой кинетикой Михаэлиса - Ментен, не может приводить к кривым
насыщения, имеющим несколько точек перегиба. Однако при наличии смеси
ферментов, один из которых проявляет положительную кооперативность, а
действие другого описывается гиперболической кинетикой, могут наблюдаться
кривые насыщения с промежуточным плато, как показано на рис. 8.36. Таким
образом, кривые с промежуточным плато могут быть результатом такого
изменения свойств фермента, обладающего положительной кооперативностью,
при котором часть его молекул утрачивает свойство кооперативности.
В некоторых случаях отрицательная кооперативность связана, вероятно, с
асимметричным расположением идентичных субъединиц в олигомерном белке,
при этом активные центры оказываются не в идентичном окружении и, строго
говоря, это не артефакт [2914, 4208]. Такой случай можно приписать
наличию в молекуле белка разных субъединиц.
Нестабильность фермента
Иногда фермент, относительно нестабильный в реакционной смеси, становится
более стабильным в присутствии высоких концентраций субстрата. Если не
учитывать это обстоятельство и не предпринимать специальных мер,
позволяющих определить истинную начальную скорость, то при низких
концентрациях субстрата можно получить заниженные значения скорости, а
