Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
Предполагают, что возбужденная молекула DANS может находиться в двух различных состояниях, различающихся степенью чувствительности к полярности микроокружения.
Лабораторная работа № 12
Исследование фотоиндуцированных изменений структурного состояния эритроцитарных мембран методом флуоресцентных зондов
Материалы и оборудование: свежеприготовленные препараты мембран эритроцитов человека, 1-анилинонафталин~8-суль-фонат, DANS-глицин, акридиновый желтый, флуоресцеин, NaOH, родамин 6Ж, акридиновый оранжевый, установка для регистрации спектров люминесценции.
Ход работы
Для регистрации спектров флуоресценции зондов 1,8-АНС и DANS-глицина в комплексе с нативными и УФ-облученными эрит-роцитарными мембранами необходимо использовать установку, описанную в работе В. Г. Артюхова, О. В. Путинцевой (1996). В ней в качестве источника света применяют ртутную лампу СВ Д-120. Возбуждающий свет выделяется с помощью светофильтра СЗС 7—2 и падает на кювету с исследуемым образцом. Люминесценцию растворов зондов измеряют при помощи многоходовой кварцевой кюветы объемом 4 мл с зеркальными стенка-
ми. Регистрируемый свет проходит через монохроматор спектрофотометра СФ-4А и фиксируется фотоумножителем ФУЭ-18А. Напряжение на ФЭУ составляет 1 кВ. Ширина щели — 1 мм. Сигнал с ФЭУ через входной блок подается на вход программируемого цифрового вольтметра В 7-43 и обрабатывается п<? встроенной программе Р4 (“среднее арифметическое из п измерений”). С целью проверки правильности работы прибора проводят его калибровку по стандартным растворам красителей: акридинового желтого, флуоресцеина в ОД н растворе NaOH, родамина
б Ж, акридинового оранжевого.
Для работы необходимо приготовить раствор АНС (препарат фирмы “Sigma”, США) на бидистиллированной воде, имеющий исходную концентрацию 5*10"3 моль/л, и спиртовой раствор DANS-глицина (содержание спирта — не более 10 %) с исходной концентрацией 10~4 моль/л.
Для исследования спектров флуоресценции 1,8-АНС в комплексе с суспензией нативных и УФ-облученных мембран указанные растворы в объеме 1,5 мл надо проинкубировать с 1,5 мл 1-10“4 моль/л водного раствора АНС при 20 °С в течение 15 мин, затем смесь внести в кювету и зарегистрировать спектр флуоресценции в интервале длин волн 430—500 нм.
Для изучения спектров флуоресценции зонда DANS-глицина в комплексе с суспензией нативных и УФ-модифицированных мембран эритроцитов указанные растворы в объеме 1 мл необходимо смешать с 0,5 мл раствора зонда и 1,5 мл 10 ммоль/л трис-HCl буфера (pH 7,6 при 20 °С) и инкубировать смесь в течение 15 мин, затем регистрировать спектры флуоресценции в интервале длин волн 500—550 нм,
I вариант
Предварительно зарегистрировать спектры поглощения и флуоресценции водного раствора зонда 1,8-АНС (контроль). Затем снять спектры люминесценции зонда в присутствии суспензии эритроцитарных мембран с учетом эффекта разведения. Полученные данные изобразить графически, откладывая по оси абсцисс длину волны измеряемого света, а по оси ординат. — интенсивность флуоресценции опытных образцов. Сделать вывод о характере изменений люминесцентных свойств 1,8-АНС в присутствии мембранного препарата.
Провести УФ-облучение эритроцитарных мембран согласно методике, описанной в лабораторной работе № 5, в дозах 0,76;
1,51; 3,02; 2,26; 4,53 кДж/м2 и зарегистрировать спектры флуоресценции зонда в присутствии модифицированных мембран. Построить график зависимости средних значений интенсив шос-ти флуоресценции АНС в его максимуме в присутствии на-тзав-ных и УФ-облученных мембран от дозы УФ-света. Сделать вывод
о причинах изменений люминесцентных характеристик АНС С в комплексе с модифицированными мембранами, индуцированных воздействием УФ-излучения в широком диапазоне длин волн, а также о характере структурных нарушений облученных эристро-цитарных мембран.
II вариант
В качестве зонда использовать DANS-глицин, все операгции проводить аналогично описанным в варианте I этой работы-
6.5. ИССЛЕДОВАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ МЕМБРАН К ДЕЙСТВИЮ ' РАЗЛИЧНЫХ ХИМИЧЕСКИХ АГЕНТОВ ПРИ ПОМОЩИ МЕТОДА РЕГИСТРАЦИИ ОСМОТИЧЕСКИХ И КИСЛОТНЫХ ЭРИТРОГРАММ*
Осмотическая резистентность клеточных популяций ьсрови является важным показателем, характеризующим проницаеаусость эритроцитарных мембран, белок-липидные взаимодействия в мембране, состояние белковых структур цитоскелета клетки.
Гемолиз эритроцитов под действием гемолитиков осуществляется через ряд последовательных стадий: предгемолитическую, стадию осмотического и химического гемоглобинолиза, строма-топороза и строматолиза. Главными показателями пред гемолитической стадии являются выход ионов калия в окружающую среду и сферуляция эритроцитов. Протекание гемоглобинолиза зависит от физико-химических свойств гемолитика. Так, при осмотическом гемоглобинолизе набухание эритроцитов до критического уровня приводит к повреждению мембраны, в результате чего свободная фракция внутриклеточного гемоглобина диффундирует наружу. Осмотический тип гемолиза не сопровождается химическими изменениями состава эритроцитов, сохраняются также и его электрические свойства. Так как осмотический гем®лиз вызывает только частичный выход гемоглобина., то из этого следует, что часть гемоглобина находится в связанной со
