Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
по объему количеством бензола и упарить на роторном испарителе или под тягой на водяной бане при 40—50 °С. Липиды взвесить и растворить в нужном объеме хлороформа для получения концентрации 10 мг/мл.
Для приготовления силикагеля 220 г силикагеля КСК, размолотого на шаровой мельнице, залить 2 л дистиллированной воды, тщательно размешать и оставить для осаждения на 40 мин. Затем надосадочную жидкость слить в другой стакан и довести водой объем до 2 л. Осадок, накопившийся в течение 2 ч, перемешать в минимальном количестве воды и оставить на ночь. Перед использованием к осадку добавить равное по объему количество воды для приготовления рабочей суспензии. При использовании силикагеля Н 1,5 г носителя размешивают в 5 мл раствора безводного карбоната натрия (6,8 мг на 100 мл воды).
Для анализа фосфолипидов используют стеклянные пластинки размером 6x6 (9x12) см с закрепленным слоем силикагеля. Для этого к 25 мл 50 %-ной суспензии силикагеля добавить 80 мг просеянного и активированного гипса. 1 мл тщательно перемешанной смеси нанести на предварительно обезжиренную стеклянную пластинку и оставить влажную пластинку для высыхания на горизонтальной поверхности. Пластинки можно хранить в эксикаторе над безводным хлористым кальцием.
Раствор 100 мкг липидной фракции в 10 мкл хлороформа нанести микрошприцем в угол пластинки на расстоянии 1 см от края. Предварительно хроматографическая камера дожна быть насыщена парами растворителей в течение 20—30 мин. Хроматографию проводят сначала в вертикальном направлении в системе 1 (хлороформ—метанол—25 % -ный водный раствор аммиака в соотношении 13:7:1) до момента достижения верхнего края пластинки фронтом растворителей. После извлечения из камеры и просушивания пластинку поместить в другую камеру с системой 2 (хлороформ—ацетон—метанол—ледяная уксусная кислота—вода в соотношении 10:4:2:2:1) и хроматографировать липиды в перпендикулярном направлении. Затем необходимо высушить пластинку, опрыснуть 10 %-ной серной кислотой в метаноле и проявить в течение 20 мин при 180 °С. В результате хроматографического разделения каждый фосфолипид занимает определенное место в виде пятна на пластинке (рис. 62). Индивидуальные пятна фосфолипидов идентифицируют с помощью цветных реакций. Фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин опре-
Рис. 62. Расположение индивидуальных фосфолипидов после проведения двумерной хроматографии в тонком слое силикагеля (Н. Ю. Каль-нова, 1992): 1 — лизофосфатидилхо-лин; 2 — сфингомиелин; 3 — фосфа-тидилхолин; 4 — фосфатидилэтанол-амин; 5 — фосфатидилсерин
деляют с помощью нингидрина. Для этого высушенные хроматограммы опрыскивают раствором нингидрина (0,3 моль/л) в бутаноле; после высушивания и нагревания пятна, соответствующие этим липидам, окрашиваются в розовый цвет. Для обнаружения холинсодержащих фосфолипидов пластинки опрыскивают раствором Драгендорфа. При этом пятна, содержащие фос-фатидилхолин, сфингомиелин и лизофосфатидилхолин, окрашиваются в ярко-розовый цвет.
Содержание фосфолипидов определяют по уровню неорганического фосфата по калибровочной прямой, полученной при помощи однозамещенного фосфорнокислого калия согласно методике, описанной в лабораторной работе № 8. Предварительно после высушивания на воздухе пластинок их проявляют в парах йода» Затем пятна быстро и аккуратно “обкалывают” иголкой, потом снимают специальной лопаточкой и переносят в пробирки. В каждую пробирку добавляют 0,1 мл 42 %-ной хлорной кислоты, нагревают при высокой температуре до обесцвечивания силикагеля и испарения кислоты. После охлаждения добавляют 0,49 мл хлорной кислоты, 0,81 мл воды, 0,4 мл 1,25 %-ного раствора молибдата аммония и 0,4 мл 5 %-ной аскорбиновой кислоты» выдерживают в кипящей водяной бане в течение 5 мин и фото-метрируют.
6.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ
КРОВИ*
Лабораторная работа М 15
Исследование каталитической активности супероксиддисмутазы в эритроцитах крови доноров
Супероксиддисмутаза (СОД) осуществляет защитную реакцию в отношении супероксидиого радикала кислорода, катализируя реакцию дисмутации 02" с образованием пероксида водорода (см. раздел ЗД)- В организме человека СОД найдена практически во всех органах и тканях; наиболее высокий уровень фермента обнаружен в эритроцитах, мозге, печени, щитовидной железе.
Молекула СОД состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой 16300 Да, связанных между собой дисуль-фидной связью.
СОД является одним из быстродействующих ферментов: константа скорости реакции ферментативной дисмутации анион-ра-дикалов составляет 2-10° моль-1* л-1.
СОД как один из основных ферментов антиоксидантной системы организма участвует не только в регуляции уровня высокореакционноспособных супероксидных анион-радикалов, но и контролирует концентрацию продуктов ПОЛ на стадии инициирования цепей окисления.
Активная генерация 02~ при воспалительных процессах сопряжена с мобилизацией антиоксидантной системы, приводящей к индукции синтеза СОД. При увеличении длительности токсического воздействия кислорода наблюдается истощение системы антиокислительной защиты организма, повышается скорость реакций ПОЛ.
