Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Артюхов В.Г. -> "Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами" -> 103

Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.

Артюхов В.Г., Наквасина М.А. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами — Воронеж, 2000. — 296 c.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani2000.pdf
Предыдущая << 1 .. 97 98 99 100 101 102 < 103 > 104 105 106 107 108 109 .. 113 >> Следующая

а) для ЛДГ из мышц свиньи:
1. Na-фосфатный буфер —¦ ОД моль/л (pH 7,4).
2. ЛДГ (буферный раствор) — 10“8 моль/л.
3. Пируват натрия (буферный раствор) — 1,5*10”3 моль/л.
4. NADH (буферный раствор — 5,4-10“5 моль/л.
б) для ЛДГ из сердца свиньи:
1. Na-фосфатный буфер — ОД моль/л (pH 7,4).
2. ЛДГ (буферный раствор) — 10“8 моль/л.
3. Пируват натрия (буферный раствор) — 0Д5-10"3 моль/л.
4. NADH (буферный раствор — 5,4-10~Б моль/л.
В кварцевую кювету для спектрофотометра поместить 2,8 мл раствора фермента и ОД мл NADH. На спектрофотометре СФ-46 при длине волны 340 нм измерить оптическую плотность Dr Затем в кювету прилить ОД мл пирувата натрия и через 30 с зарегистрировать оптическую плотность D2. Каталитическую активность ЛДГ (А) рассчитывают по формуле
д_Д^340 ' Хир е •/ t ’
где AD340 = Dx — D2 — изменение величины оптической плотности реакционной смеси при 340 нм; е — молярный коэффициент поглощающего соединения (NADH), равный 6,22*103 л (моль-1 чем-1); / — длина оптического пути (1 см); t — время инкубации реакционной смеси (30 с); Vnp — конечный объем реакционной смеси (3 мл). Активность ЛДГ выражают в микромолях превращенного NADH в минуту.
Лабораторная работа № 19
Выделение лактатдегидрогеназы из сердца свиньи
Материалы и оборудование; 0,2 моль/л Na-фосфатный буфер (pH 7,2), ОД моль/л Na-фосфатный буфер (pH 7,2), ОД моль/л На-фосфатный буфер (pH 7,5), сульфат аммония мелкоизмель-ченный, сульфат аммония (0,5 насыщения), ацетон, хлорид натрия “(лед), хлорид кальция, концентрированный раствор аммиака, гомогенизатор (“Homogenizer type 302”, Польша), магнитная мешалка, центрифуга MPW-360, центрифужные пробирки, стеклянная посуда, фильтровальная бумага.
Ход работы
Для приготовления кальций-фосфатного геля к 0,5 л 0,44 моль/л Na2HP04 при энергичном перемешивании быстро добавить 0,5 л 0,66 моль/л СаС12. Концентрированным раствором аммиака довести pH раствора до значений 8,2—8,6. Полученную суспензию поместить в стеклянный цилиндр объемом 2 л, налить бидистиллированную воду и перемешать. После оседания геля жидкость декантировать. Оставшуюся суспензию вновь залить водой, перемешать и отстаивать. Аналогичную процедуру повторять до тех пор, пока в промывных водах не исчезнут ионы хлора. После этого общий объем суспензии довести водой до 1 л. Гель надо готовить за 1—2 дня до использования и хранить в холодильнике.
Все работы с растворами фермента необходимо проводить на ледяной бане и в холодной комнате.
Экстракция. Охлажденные свиные сердца освободить от жировой и соединительной ткани и гомогенизировать при 10000 об/мин (“Homogenizer type 302”, Польша). Около 400 г измельченной ткани залить 1,5 л холодной бидистиллированной воды, перемешать в течение 20 мин при помощи магнитной мешалки, отжать через несколько слоев марли и фильтровать для удаления жира через стеклянную вату.
Обработка калъций-фосфатиым гелем. К экстракту при перемешивании добавить 0,3 л суспензии кальций-фосфатного геля. Перемешивание продолжать еще 5 мин и затем отстаивать. Через 30 мин прозрачную жидкость над осадком просифонировать и отбросить, а оставшуюся суспензию центрифугировать 15 мин при 2000 g на рефрижераторной центрифуге MPW-360 (Польша).
К осадку добавить 0,2 л 0,2 моль/л фосфатного буфера с pH 7,2, перемешать до получения однородной суспензии и центрифугировать 15 мин при'2000 g. Надосадочную жидкость слить, а к осадку добавить 0,15 л 0*2 моль/л фосфатного буфера (pH 7,2). Тщательно перемешать и центрифугировать 15 мин при 2000 g.
Первое осаждение сульфатом аммония. К объединенным цен-трифугатам, полученным на предыдущей стадии, при перемешивании отдельными порциями добавить сульфат аммония до 0,6 насыщения. Перемешивать еще 15 мин, затем центрифугировать при 2600 g в течение 30 мин.
Первое осаждение ацетоном. Осадок растворить в 40 мл
0,1 моль/л фосфатного буфера с pH 7,2 и к полученному раствору добавить' предварительно охлажденный до -15 °С ацетон в количестве 60,4 мл на каждые 100 мл ферментативного раствора. Поднять температуру до 13 °С и инкубировать смесь 10 мин, затем центрифугировать при 2600 g в течение 15 мин, К осадку добавить 20 мл сульфата аммония 0,3 насыщения. Перемешать до получения однородной суспензии и через 30 мин центрифугировать 40 мин при 2600 g.
Второе осаждение сульфатом аммония. К центрифугату добавить сульфат аммония до 0,5 насыщения. Перемешать в течение 10 мин и оставить в холодильнике на 6—8 ч. Центрифугировать 40 мин при 2600 g и осадок растворить в 5,5 мл холодной бидистиллированной воды.
Второе осаждение ацетоном. К ферментному раствору, как и в первый раз, добавить ацетон, охлажденный до -15 °С. Температуру поднять до 18 °С, выдержать 10 мин, затем центрифугировать 15 мин при 2600 g. Осадок суспендировать в 2 мл сульфата аммония 0,3 насыщения.
Кристаллизация. К ферментному раствору присыпать сульфат аммония до 0,5 насыщения. Перемешать и оставить в холодильнике на ночь. Центрифугировать 20 мин при 2600 g и осадок растворить в сульфате аммония 0,3 насыщения. К суспензии добавить сульфат аммония до 0,5 насыщения. Описанную процедуру повторить три раза. Суспензию кристаллов фермента хранить в холодильнике.
Предыдущая << 1 .. 97 98 99 100 101 102 < 103 > 104 105 106 107 108 109 .. 113 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed