Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
Применение лекарственных форм СОД или СОД-активных соединений позволяет снижать концентрацию 02\ Таким образом, состояние антиоксидантной защиты и, в частности, уровень СОД, отражает компенсаторные возможности организма при различных состояниях, связанных со свободнорадикальной патологией.
Материалы и оборудование: кровь доноров, хлорид натрия, хлороформ, этанол, 0,01 моль/л Na-фосфатный буфер (pH 8,5),
* Раздел написан с участием О. В. Башариной.
этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), тетраметилэтилендиа-мин (ТЭМЭД), нитросиний тетразолиевый (НСТ), рибофлавин, калий йодистый, центрифуга MPW-340, центрифужные весы, спектрофотометр СФ-46, кварцевые кюветы для спектрофотометра, стеклянные пипетки, пробирки, фильтровальная бумага.
Ход работы
Метод определения активности СОД основан на ее способности конкурировать с красителем нитросиним тетразолиевым за супероксидные анион-радикалы, образующиеся при генерации их в системе тетраметилэти лен диамин—рибофлавин. В ходе реакции НСТ восстанавливается с образованием гидразинтетразолия, характеризующегося максимумом поглощения при 540 нм. В присутствии СОД степень восстановления НСТ уменьшается.
Выделить эритроциты из крови доноров согласно методике, описанной в лабораторной работе №1. 500 мкл эритроцитов ге-молизировать на холоде с равным объемом дистиллированной воды. Для удаления гемоглобина эритроциты обработать 400 мкл хлороформ-этаноловой смеси (3:5), добавить 100 мкл воды и оставить на 30 мин при +4 °С. Гемолизат центрифугировать при 4000 об/мин в течение 10 мин, отобрать 50 мкл супернатанта и смешать с 600 мкл дистиллированной воды.
Реакционная смесь содержит:
1. Фосфатный буфер — 0,5 мл;
2. ТЭМЭД (0,05 моль/л) в 0,2 моль/л ЭДТА — 0,5 мл;
3. НСТ (0,85 ммоль/л) — 0,5 мл;
4. Вода дистиллированная — 2,5 мл;
5. Раствор, содержащий СОД, — 50 мкл;
6. Рибофлавин (0,034 ммоль/л) — 1 мл.
В контрольную пробу раствор фермента не добавлять. Реакция инициируется облучением лампой дневного свет (мощность
20 Вт) на расстоянии 20 см в течение 5 мин. Для остановки реакции прилить 0,5 мл раствора KJ (1 %). Оптическую плотность зарегистрировать на спектрофотометре СФ-46 при 540 нм. За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое обеспечивает ингибирование восстановления: нит-росинего тетразолиевого на 50 %. Активность СОД рассчитывают по формуле
А = (К - 0)/К*100 %,
где А — активность фермента в уел. единицах; К — оптическая плотность контрольной пробы; О — оптическая плотность опытной пробы.
Лабораторная работа М 16
Определение активности каталазы в эритроцитах крови человека спектрофотометрическим методом
Каталаза (пероксид водорода: пероксид водорода — оксидоре-дуктаза, 1.11.1.6) разрушает пероксид водорода, образующийся прямым путем при восстановлении кислорода или более сложным путем при дисмутации супероксидных радикалов. Этот фермент катализирует двухэлектронное восстановление Н202 до Н20, используя Н202 как донор электрона. Каталаза в клетке локализована в микротельцах (пероксисомах), входит в состав лизосом.
Молекулярная масса каталазы из различных источников составляет 225—251 кДа. Молекула каталазы состоит из 4 идентичных субъединиц и 4 групп гематина.
Следует отметить, что каталаза проявляет и умеренную пероксидазную активность, т.е. катализирует реакцию окисления органических веществ пероксидом водорода.
Считают, что каталаза всегда присутствует в биосистемах, где происходят процессы клеточного дыхания с участием цитохро-мов, т.е. там, где в результате восстановления кислорода образуется пероксид водорода, который весьма токсичен для живой клетки и поэтому должен быть удален.
В связи с тем, что каталаза локализуется преимущественно в печени и эритроцитах, целесообразно определять ее активность в сыворотке крови при заболеваниях печени и гемолитических процессах.
Материалы и оборудование: кровь доноров, хлорид натрия, хлороформ, этанол, 0,01 моль/л Na-фосфатный буфер (pH 6,7), этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), пероксид водорода, 10 %-ный раствор серной кислоты, центрифуга MPW-340, центрифужные весы, спектрофотометр СФ-46, кварцевые кюветы для спектрофотометра, стеклянные пипетки, пробирки, фильтровальная бумага.
Работа включает 3 этапа (а, б, в).
а) Получение эритроцитов
Эритроциты получают из цельной крови человека путем центрифугирования на центрифуге MPW-340 при 1500 об/мин
в течение 15 мин. Сыворотку отбирают с помощью пастеровской пипетки, добавляют к эритроцитам равный объем 0,9 %-ного раствора NaCl и повторно центрифугируют в том же режиме. Эритроциты отмывают таким способом в растворе NaCl 3 раза. Затем 2 мл эритроцитов разводят 0,9 %-ным раствором NaCl в соотношении 1:1000 до значений оптической плотности D=0,7 при 410 нм, что соответствует концентрации 1,5*108 кл/мл.
б) Получение гемолизата эритроцитов, свободного от гемоглобина
К 0,5 мл эритроцитов добавляют 0,5 мл бидистиллированной воды для нарушения целостности эритроцитарных мегдбран и оставляют на холоде в течение 15—20 мин.
