Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Артюхов В.Г. -> "Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами" -> 95

Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.

Артюхов В.Г., Наквасина М.А. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами — Воронеж, 2000. — 296 c.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani2000.pdf
Предыдущая << 1 .. 89 90 91 92 93 94 < 95 > 96 97 98 99 100 101 .. 113 >> Следующая

К "(А -Ак)/е,
где К — количество продуктов ПОЛ; Ао — оптическая плотность опытного раствора; Ак — оптическая плотность контрольного раствора; е — молярный коэффициент экстинкции, равный в данном случае 1,56*105 моль-1-см'1.
Образование комплекса ТБК—МДА регистрируют также флуоресцентным методом. Для этого к 0,1 мл 3%-ного раствора доде-цилсульфата натрия добавляют 1,5 мл 2 моль/л ацетатного буфера (pH 3,6) и 0,8%-ного раствора ТБК, доводят бидистиллиро-ванной водой до 4 мл. Полученную смесь инкубируют при 95 °С в течение 60 мин. После охлаждения добавляют 1 мл 0,2 н соляной кислоты и 5 мл смеси н-бутанол-пиридин в объемном соотношении 15:1 и перемешивают. Центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин, отделяют надосадочную жидкость и регистрируют ее спектр флуоресценции в области длин волн 450—600 нм. Затем определяют интенсивность люминесценции в ее максимуме («515 нм). Чувствительность метода по стандарту МДА составляет 0,5 нмоль при использовании чистых образцов ТБК.
6.4. ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ СТРУКТУРНОГО СОСТОЯНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ
Современным биофизическим методом исследования, позволяющим изучать структурное состояние биомембран, транспорт ионов, трансмембранный потенциал, взаимодействие веществ различной природы с мембранами и другие процессы, признан метод флуоресцентных зондов.
“Универсальным” мембранным флуоресцентным зондом, реагирующим на самые разнообразные перестройки, которые могут происходить в мембранах, служит 1 -анилинонафталин-8-суль-фонат (АНС):
АНС был первым зондом, который использовал Д. Лоуренс в 1952 г. для исследования мембранных структур. Он является классическим примером зонда, распределяющегося между водной и мембранной фазами в измеримой пропорции. АНС флуоресцирует практически только в связанном с мембраной состоянии. Причем флуоресценция связанного с мембраной красителя заметно отличается по своим характеристикам от его флуоресценции в водной фазе, что позволяет делать заключение о характере микроокружения хромофорных групп молекул зонда.
Исследователя, использующего флуоресцентные зонды, интересует положение максимумов их спектров поглощения и флуоресценции не только в связи с необходимостью выбора правильных условий возбуждения и измерения флуоресценции, но и потому, что величина стоксова сдвига (длинноволновый сдвиг максимума флуоресценции по отношению к максимуму поглощения) отражает такое важное свойство среды, как полярность. Величина стоксова сдвига определяется следующими условиями:
а) изменением дипольного момента молекулы при переходе из основного в возбужденное состояние;
б) электронной и ориентационной поляризуемостью окружающих зонд молекул.
03S HN
Спектр поглощения АНС в водном растворе имеет максимум в области длин волн 350—360 нм, а спектр флуоресценции — при 478—480 нм.
При связывании данного красителя мембранами или белками в определенной мере изменяются все параметры поглощения и флуоресценции, так как зонд оказывается в среде менее полярной и менее текучей, чем водный раствор. При взаимодействии АНС с различными мембранами происходит изменение положения максимумов поглощения и флуоресценции, интенсивности и степени поляризации флуоресценции, анизотропии поляризованной флуоресценции. Эти изменения позволяют количественно оценить степень связывания зонда с мембранами. Вместе с тем следует учитывать и тот факт, что характеристики связавшегося зонда сильно зависят от состава исследуемых мембран (митохондриальных, фосфолипид ных, плазматических). Еще более чувствительным параметром является интенсивность флуоресценции, так как она определяется еще и количеством связавшегося зонда.
Сейчас трудно однозначно ответить на вопрос о локализации АНС в белково-липидных мембранах. Предполагают, что молекула зонда не может глубоко погрузиться в липидный бислой, так как заряженная сульфогруппа должна оставаться на поверхности. Кроме того, горизонтальная ориентация длинной оси его молекулы не позволяет погрузить в бислой фенильное кольцо. Скорее всего, в плазматических мембранах часть АНС связана с белками, а часть — с липидами. В пользу этого представления приводят данные о двух компонентах кривой затухания флуоресценции АНС в белково-липидных мембранах, из которых компонента с большим временем жизни преимущественно обусловлена молекулами зонда, связанными с белками, а вторая — с липидами.
1-Диметиламино-5-нафталиносульфохлорид (DANS) способен ковалентно присоединяться к свободным аминогруппам и является хромофором многих флуоресцентных зондов. DANS-глицин имеет следующую структурную формулу:
СНз СН3 N
о" 0=3=0 \ I c-ch2-nh // о
Аминогруппа DANS-глицина, с одной стороны, сопряжена с тс-электронной системой нафталина, а с другой — взаимодействует с растворителями, полностью изменяя как спектр поглощения нафталина, так и его флуоресцентные свойства. При возбуждении молекулы аминогруппа поворачивается в одну плоскость с кольцами нафталина, при этом дипольный момент молекулы увеличивается. Появляется большой стоксов сдвиг спектра флуоресценции, сильно зависящий от полярности растворителя. Взаимодействие аминогруппы с протонодонорными растворителями (особенно водой) приводит к тушению флуоресценции, причем D20 тушит флуоресценцию DANS в 2—3 раза слабее, чем Н20. Если аминогруппа присоединяет протоны, то в процесс взаимодействия вступает электронная пара атома азота, ранее связанная с кольцом. В результате сопряжение исчезает, а вместе с ним — длинноволновая полоса поглощения и связанная с ней флуоресценция.
Предыдущая << 1 .. 89 90 91 92 93 94 < 95 > 96 97 98 99 100 101 .. 113 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed