Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
Доза
3,78 кДж/м2
Сделать вывод о степени и характере изменений функциональной активности ацетилхолинэстеразы эритроцитарных мембран, модифицированных воздействием УФ-света в различных дозах. Какие процессы, протекающие при УФ-облучении эритроцитарных мембран, обусловливают изменения каталитической активности мембраносвязанной АХЭ? Какова зависимость ферментативной активности АХЭ эритроцитарных мембран от дозы УФ-облучения?
Лабораторная работа № 6
Исследование ферментативной активности свободной и мембраносвязанной ацетилхолинэстеразы в интактном состоянии и после УФ-облучения
Материалы и оборудование: 2 моль/л раствор солянокислого гидроксиламина, 10 %-ный раствор хлорного железа, приготовленный на 0,1 моль/л растворе соляной кислоты, 3,5 моль/л раствор гидроксида натрия, ОД моль/л раствор соляной кислоты, ацетилхолинхлорид, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, установка для УФ-облучения, кровь доноров, готовый препарат ацетилхолинэстеразы из эритроцитов быка, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Ход работы
Предварительно выделить мембраны эритроцитов из крови согласно методике, описанной в лабораторной работе № 1. Используя описание методики в лабораторной работе № 5, провести определение каталитической активности АХЭ эритроцитарных мембран в норме и при воздействии УФ-излучения в дозах 1,5; 3,0; 4,5 кДж/м2. Данные занести в таблицу, аналогичную табл. 19. Те же эксперименты провести с буферными растворами свободной ацетилхолинэстеразы (10~8 моль/л). Оформить табл. 19 для фермента в свободном состоянии. Результаты представить в виде графика, где по оси абсцисс отложены величины доз УФ-света, а по оси ординат — значения активности АХЭ, выраженные в процентах от уровня контрольного образца, для свободного (кривая 1) и мембраносвязанного (кривая 2) фермента. Сделать вывод об уровне фоточувствительности разных форм фермента. Чем могут быть обусловлены различия в характере УФ-индуцирован-ных изменений функциональной активности свободной и связанной АХЭ?
Лабораторная работа № 7
Определение функциональной активности ацетилхолинэстеразы эритроцитарных мембран после индукции пероксидного окисления липидов
Мембранные ферменты изменяют свою активность под влиянием продуктов ПОЛ, что может быть обусловлено образованием комплекса окисленный липид — белок, ассоциацией белко-
вых молекул и разрушением аминокислот, в частности, содержащих SH-группы.
Цель работы — выявление изменений функциональной активности АХЭ эритроцитарных мембран после индукции аскор-батзависимого пероксидного окисления липидов. Ионы Fe2+ оказывают каталитическое действие на образование пероксидов. При этом Fe2+ окисляется до Fe3+, а функция аскорбиновой кислоты заключается в регенерации ионов за счет обратного восстановления Fe3+ до Fe2+.
Материалы и оборудование: 2 моль/л раствор солянокислого гидроксиламина, 10 %-ный раствор хлорного железа, приготовленный на 0,1 моль/л растворе соляной кислоты, 3,5 моль/л раствор гидроксида натрия, 0,1 моль/л раствор соляной кислоты, ацетилхолинхлорид, сульфат железа FeS04, аскорбиновая кислота, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Ход работы
Выделить эритроцитарные мембраны по методике, описанной в лабораторной работе № 1. К 1 мл суспензии эритроцитарных мембран добавить 150 мкл смеси растворов FeS04 (100 мкмоль/л) и аскорбиновой кислоты (2 ммоль/л) и инкубировать 5,15, 30, 45 и 60 мин при 37 °С. Затем провести определение ферментативной активности АХЭ нативных и модифицированных мембран. Параллельно исследовать уровень ТБК-реактивных продуктов пероксидного окисления липидов (см. лабораторную работу № 11). После завершения экспериментов сопоставить динамику изменений величин активности АХЭ в процессе развития ПОЛ эритроцитарных мембран и уровня накопленных окисленных продуктов липидов.
Лабораторная работа М 8
Исследование функциональной активности мембраносвязанной Na+, К+-АТФазы
Распространенные методы изучения функциональной активности Na+, К'н-АТФазы основаны на определении количества неорганического фосфата, содержащегося в исследуемом растворе. Существуют различные методы обнаружения фосфата в биообъектах. Но все они основаны на том, что в кислой среде молибде-
новокислый аммоний и фосфорная кислота (ее соли) взаимодействуют между собой с образованием фосфомолибдата аммония, восстановление которого приводит к образованию смеси различных оксидов молибдена, имеющих синий цвет. Появившаяся окраска устойчива в течение 1—2 ч. Для ее стабилизации применяют CuS04. Различные методы отличаются природой восстановителя и кислотностью среды, что определяет скорость реакции и чувствительность метода.
Материалы и оборудование: хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния, строфантин, ЭДТА, АТР, трис-HCl буфер (pH 7,4), трихлоруксусная кислота, термостат, аскорбиновая кислота, мо-либдат аммония, однозамещенный фосфат калия, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
