Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
Далее готовят рабочий раствор: в цилиндр на 100 мл наливают 50 мл 2 % -ного раствора Na2C03, в отдельную пробирку — 0,5 мл 2 %-ного тартрата натрия и 0,5 мл 1 %-ного сульфата меди. Содержимое пробирки выливают в цилиндр и образовавшейся смесью ополаскивают пробирку и опять выливают в цилиндр. Смесь перемешивают и оставляют на 10 мин.
В пробирки разливают по 0,1 мл суспензии мембран, затем — по 0,1 мл 0,4 н раствора NaOH (пробирки можно нагреть для лучшего растворения белка). Добавляют бидистиллированную
воду до 0,4 мл. Смешивают с 2 мл рабочего раствора, перемешивают содержимое пробирок и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем добавляют 0,2 мл реактива Фолина, перемешивают и оставляют на 30—40 мин для развития окраски. Измеряют оптическую плотность растворов при длине волны 750 нм на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре. Содержание белка в пробах определяют по калибровочному графику, построенному с использованием бычьего сывороточного альбумина. Для этого готовят серию растворов белка с содержанием от 20 до 400 мкг в 1 мл. Определение ведут так же, как и для опытных растворов (см. выше), количество повторностей для каждой концентрации белка — не менее 5. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс содержание белка в пробе, а по оси ординат - ее оптическую плотность при 750 нм.
Лабораторная работа № 3
Количественное определение белка по биуретовой реакции
Материалы и оборудование: сульфат меди, гидроксид натрия, хлорид натрия, тартрат натрия-калия, йодид калия, бычий сывороточный альбумин, суспензия мембран, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, стеклянные кюветы для КФК, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Ход работы
Для приготовления биуретового реактива в мерную посуду на 250 мл вносят 0,375 г сульфата меди; 1,5 г тартрата натрия-калия и растворяют в 150 мл воды. При энергичном перемешивании добавляют 75 мл 10 %-ного раствора NaOH и 1 г йодида калия и доводят содержимое до 250 мл водой. Реактив хранят в полиэтиленовом сосуде, покрытом изнутри парафином, так как он не подлежит длительному хранению.
В пробирки помещают по 0,2 мл исследуемого раствора, содержащего белок, доводят бидистиллированной водой до 1 мл, добавляют 4 мл биуретового реактива и перемешивают. В контрольную пробирку вместо белка наливают воду. Через 30 мин измеряют оптическую плотность проб (развивается сине-фиолетовое окрашивание за счет пептидных связей) при длинах волн 540—650 нм против контроля (для более точного определения зарегистрировать спектр поглощения проб и выявить А,тах против контрольного раствора).
Содержимое белка в пробах определяют по калибровочному графику с использованием бычьего сывороточного альбумина. Стандартные растворы бычьего сывороточного альбумина должны содержать от 1 до 10 мг белка в 1 мл 1 %-ного раствора хлорида натрия. Определение ведут так же, как в случае опытных проб.
6.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МЕМБРАНОСВЯЗАННЫХ ФЕРМЕНТОВ В НОРМЕ И ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
Для исследования отдельных свойств нативных мембран клеток, а также для изучения молекулярных механизмов регулирования метаболических процессов, осуществляющихся с участием мембранных компонентов клетки, используются различные физико-химические методы модификации мембран.
Химические способы модификации мембранных структур связаны с использованием естественных и синтетических соединений. К группе естественных модифицирующих агентов, изменяющих липидный состав мембран в нативной клетке, относятся липидпереносящие белки, ферменты обмена фосфолипидов — фосфолипазы, диметилазы, системы обмена холестерина. Они регулируют микровязкость и подвижность мембранных компонентов, которые являются важнейшими факторами поддержания нормальной структурно-функциональной организации и обеспечения взаимодействия мембран.
Синтетические биологически активные вещества используют для индукции проницаемости природных и искусственных мембран. К ним относятся ионофоры (валиномицин, обеспечивающий проникновение ионов калия через мембрану; крауны — мак-роциклические полиэфиры, обеспечивающие проницаемость мембран для ионов натрия, кальция, магния) и каналообразователи (например, аламетицин, способствующий проникновению через мембрану АТР).
К физическим методам модификации липидных и белковых компонентов биомембран относят ионизирующее и УФ-излуче-ние, температуру.
Лабораторная работа М 4
Определение функциональной активности ацетилхолинэстеразы эритроцитарных мембран
Метод Хестрина основан на колориметрическом определении концентрации ацетилхолина. Его чувствительность составляет
5 мкг ацетилхолина. Ошибка определения ±1 %. Достоинство этого метода при определении активности АХЭ состоит в том, что он позволяет исследовать кинетику ферментативной реакции при различных условиях, позволяет работать в широком интервале концентраций субстрата, производить массовые определения, удобен для регистрации активности АХЭ различного происхождения в стандартных условиях (определенные концентрации фермента и субстрата, стандартное время реакции при условии соблюдения нулевого порядка).
