Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
центрифугировать на центрифуге ЦЛР-1 У4.2 при 18000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удалить, а осадок мембран промыть три раза 20 объемами 10 ммоль/л трис-ЫС1 буфера (pH 7,6 при 20 °С), каждый раз осаждая мембраны в том же режиме.
В экспериментах использовать свежеприготовленную суспензию мембран.
Препараты мембран эритроцитов можно получить с помощью метода молекулярного сита. Для этого применяют гель-хроматографию на сефарозе 4В (“Pharmacia”, Швеция). Сефароза 4 В представляет собой гель агарозы, которая поставляется в набухшем состоянии. Преимущество этого геля по сравнению с другими носителями для хроматографии заключается в его способности разделять комплексы биополимеров, полисахариды, мембраны и фрагменты клеток. Для эффективного отделения гемоглобина от мембран необходимо лизировать эритроциты не менее, чем двумя объемами буфера. Установлены оптимальные условия для разделения на сефарозе 4В: 4 ммоль/л фосфатный буфер (pH 7,5). На колонку размером 1,5x5,1 см можно наносить до 1 мл гемолизата (гемолизат должен быть приготовлен из расчета
1 объем эритроцитов : 1 объем гемолизирующей среды), при этом выход мембран составляет до 1 мл. Методом электрофореза в ПААТ в присутствии додецилсульфата натрия показано, что мембраны, выделенные гель-хроматографией, содержат тот же набор белков, что и мембраны, полученные методом промывания и центрифугирования.
Лабораторная работа № 2
Определение концентрации белка плазматических мембран
по методу Лоури
При выделении препарата мембран оценивают количественный выход белка. Метод Лоури (1951) - наиболее распространенный и высокочувствительный метод определения концентрации белка, основанный на измерении интенсивности окраски раствора, зависящей от концентрации белка. Принцип метода заключается в том, что при взаимодействии белка с реактивами, используемыми в определении, осуществляются по меньшей мере две цветные реакции на белок. Одна из них — биуретовая реакция между пептидными группами и ионами меди. Возникающая сине-фиолетовая окраска обусловлена об-
разованием комплексного соединения — биуретового медного комплекса:
О- 0“
I I
С = NH HN = С
/ Ч ^ \
HN О--------- Си ---------О NH
\l S N I/
С = NH HN = С
Такое комплексное соединение претерпевает в щелочной среде енолизацию по схеме:
ОНО
II I II
HoN- С - N- С - NH4 о HN= С - NH- С = NH
I I
ОН он
Две молекулы диенольной формы биурета взаимодействуют с гидроксидом меди (II) и образуют комплексное соединение, в котором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота -иминных групп:
R"
I
СН —
У
в цепь
в цепь
Такие медные комплексы обладают преимущественно фиолетовой и синей окраской.
Вторая реакция — это реакция реактива Фолина с тирозино-выми и цистеиновыми радикалами молекулы белка. Это реакция восстановления смеси фосфорно-вольфрамовой и фосфорномолибденовой кислот (реактив Фолина) с образованием комплексного соединения синего цвета. Полагают, что в реакции восстановления принимают участие комплексные соединения меди, возникающие при взаимодействии белка со щелочным раствором сульфата меди. Эта реакция не очень специфична, но высо-
кочувствительна. Преимущество метода Лоури состоит в возможности определения белка в сильно разбавленных растворах (десятки мкг).
Материалы и оборудование: вольфрамат натрия Na2W04*2H20, молибдат натрия Na2Mo04*2H20, 80 %-ная фосфорная кислота, концентрированная соляная кислота, сульфат лития, бром, гидроксид натрия, карбонат натрия, тартрат натрия, сульфат меди, бычий сывороточный альбумин, суспензия мембран, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, стеклянные кюветы для КФК, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Ход работы
Реактив Фолина готовят следующим образом: 100 г вольфра-мата натрия и 25 г молибдата натрия растворяют в 700 мл воды в круглодонной колбе на 1 л, снабженной пришлифованным холодильником Либиха. Прибавляют 50 мл 80 %-ной фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. Помещают в колбу несколько капилляров. Смесь кипятят в колбе с обратным холодильником в течение 10 ч. Далее прибавляют 150 г сульфата лития, 50 мл воды и несколько капель брома. Для удаления избытка брома кипятят содержимое колбы в течение 15 мин без обратного холодильника под тягой. Раствор охлаждают, доводят водой до 1 л и пропускают через стеклянный фильтр. Реактив Фолина хранят в химической посуде из темного стекла. На всех этапах приготовления реактива цвет реакционной смеси должен быть желтым. Реактив Фолина титруют 1 н раствором щелочи и на основании полученных данных рассчитывают его кислотность. Перед использованием реактив Фолина разбавляют водой до кислотности, соответствующей 1 н раствору соляной кислоты.
