Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Артюхов В.Г. -> "Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами" -> 91

Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.

Артюхов В.Г., Наквасина М.А. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами — Воронеж, 2000. — 296 c.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка): biologicheskiemembrani2000.pdf
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 113 >> Следующая

Принцип метода: при взаимодействии ацетилхолина с щелочным раствором гидроксиламинхлорида образуется ацетил-гидроксамовая кислота, которая в кислом растворе дает с хлорным железом цветную реакцию:
(CH3)N+CH2CH20C(0)CH3 + NH2OH = (CH3)3N+CH2CH20H +
+ CH,C(0)NH0H
Материалы и оборудование: 2 моль/л раствор солянокислого гидроксиламина, 10 % -ный раствор хлорного железа, приготовленный на ОД моль/л растворе соляной кислоты, 3,5 моль/л раствор гидроксида натрия, 0,1 моль/л раствор соляной кислоты, ацетилхолинхлорид, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Ход работы
Предварительно выделить мембраны эритроцитов из крови согласно методике, описанной в лабораторной работе № 1.
Для построения калибровочного графика необходимо приготовить растворы ацетилхолинхлорида с концентрациями 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 ммоль/л ацетилхолинхлорида. Определить оптическую плотность этих растворов против раствора сравнения (последовательность операций см. ниже). Построить калибровочный график, где по оси ординат отложена оптическая плотность растворов ацетилхолинхлорида, а по оси абсцисс — концентрация этого вещества. В пределах указанных концент-
раций ацетилхолина калибровочная прямая должна подчиняться закону Бугера—Ламберта—Бера.
Для приготовления раствора сравнения в пробирку налить реактивы в такой последовательности: 2 мл раствора хлорного железа, 2 мл соляной кислоты, 1 мл щелочного гидроксиламина,
1 мл 2,5 ммоль/л раствора ацетилхолинхлорида и 1 мл дистиллированной воды. Цвет смеси должен быть лимонно-желтым.
В контрольную и опытную пробирки налить соответственно по 1 мл бидистиллированной воды и суспензии мембран эритроцитов. Затем добавить в них по 2 мл 2,5 ммоль/л раствора ацетилхолинхлорида и поместить пробирки в термостат при 37 °С на 15 мин. После термостатирования прилить по 1 мл раствора щелочного гидроксиламина (готовят перед употреблением путем смешивания равных объемов раствора солянокислого гидроксиламина и гидроксида натрия). Через 15 мин в опытную и контрольную пробы добавить по 2 мл раствора соляной кислоты и по 2 мл раствора хлорного железа. Через 20 мин оптическую плотность опытной и контрольной проб измерить на фотоэлектроколориметре против раствора сравнения. Для расчета активности фермента из величины оптической плотности контрольной пробы вычитают величину оптической плотности опытной пробы. Активность ацетилхолинэстеразы выражают в ммоль/л ацетилхолина с использованием калибровочного графика.
Лабораторная работа М 5
Исследование УФ-индуцнрованных изменений функциональной активности ацетилхолинэстеразы
эритроцитарных мембран
Материалы и оборудование: 2 моль/л раствор солянокислого гидроксиламина, 10 %-ный раствор хлорного железа, приготовленный на ОД моль/л растворе соляной кислоты, 3,5 моль/л раствор гидроксида натрия, ОД моль/л раствор соляной кислоты, ацетилхолинхлорид, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, установка для УФ-облучения, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумага.
Ход работы
Предварительно выделить мембраны эритроцитов из крови согласно методике, описанной в лабораторной работе № 1.
Один объем (3 мл) суспензии мембран эритроцитов использовать в качестве контрольного образца и разлить по трем пробиркам, второй (9 мл) — разделить на три части (по 3 мл) и подвергнуть воздействию УФ-света в дозах 0,75; 2,27; 3,78 кДж/м2 при помощи установки для ультрафиолетового облучения биосистем, которая подробно описана в учебном пособии В. Г. Артю-хова, О. В. Путинцевой (1996). Облучение суспензии мембран эритроцитов в трис-HCl буферном растворе (pH 7,6) проводят в стеклянной термостатируемой кювете (20±1 °С) при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки излучением лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 (с полосой пропускания 240—390 нм). Интенсивность облучения через этот светофильтр составляет 0,151 кДж/м2 в 1 мин. Затем определить каталитическую активность ацетилхолинэстеразы в контрольных и опытных (при всех дозах облучения) пробирках по методике, описанной в лабораторной работе № 4. Полученные данные занести в табл. 19.
Таблица 19 Ферментативная активность ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека до и после УФ-облучения
Образец Активность ацетилхолинэстеразы, Активность АХЭ,
ммоль/л ацетилхолина % от исходного
1-е опреде 2-е опреде 3-е опреде A±S.
ление ление ление А
Контроль 100 %
Доза
0,75 кДж/м2
Доза
2,27 кДж/м2
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 113 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed