Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
С целью преодоления недостатков вышеуказанного метода для оценки чистоты мембранных фракций удобнее использовать не ферменты, а специфические рецепторы лектинов, гормонов, антител. В том случае, если мембрана имеет четкие морфологические признаки, в качестве критерия применяют метод электронной микроскопии. Если хорошо изучен химический состав определенного типа мембран, то для контроля чистоты мембранных структур используют анализ белкового и липидного состава (например, методом электрофореза в ПААТ в присутствии ДСН или путем определения содержания холестерина).
5.4. ВЫДЕЛЕНИЕ Д ОЧИСТКА МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ
Исследование структурно-функционального состояния мембранных белков осуществляют после проведения двух важнейших этапов:
— выделения и очистки определенного белка;
— анализа полученной фракции для определения ее чистоты и исследования структуры чистого компонента.
В разделе 5.2. были охарактеризованы методы выделения мембранных структур, которые широко используются и для получения мембранных белков. Поэтому остановимся на некоторых вопросах, касающихся очистки интегральных мембранных белков с применением детергентов.
Детергенты — это группа амфифильных соединений, которые способны связываться с гидрофобными участками мембранных белков, контактирующими с липидной фазой мембран, тем самым разрушая ее структуру. В ходе солюбилизации мембран детергентами последние модифицируют бислой липидов, разрыхляя его, затем образуют смешанные (белок-липид-детергентные) мицеллы, а в конечном итоге — детергент-белковые и липид-детергентные мицеллы. Для сохранения мембранных белков в растворимом состоянии необходимо постоянное присутствие детергента. Его удаление приводит к агрегации и последующему осаждению молекул белка.
Основной проблемой очистки белков является подбор детергента и оптимальных условий солюбилизации их молекул. Детергент не должен нарушать высшие типы пространственной организации белков, а лишь замещать молекулы липидов, контактирующие с гидрофобными участками белковой глобулы. Критерий максимальной солюбилизации белка — переход его молекул в надосадочную жидкость после осаждения мембран. Причем важным требованием процедуры солюбилизации является сохранение функциональной активности биополимера и его стабилизация. Для этого в исследуемую систему добавляют экзогенные фосфолипиды, глицерин, ингибиторы про-теаз. Следует отметить, что получаемые при очистке белок-детергентные комплексы могут содержать значительные количества связанных фосфолипидов, что необходимо учитывать при дальнейшем разделении и характеристике получаемого препарата белка.
При выборе детергента необходимо учитывать:
1) критическую концентрацию мицеллообразования и размер мицелл детергента;
2) заряд детергента;
3) возможность осаждения при определенном значении pH;
4) возможность светопоглощения в диапазоне длин волн, используемом при определении концентрации белка оптическим методом (при 280 нм).
Если концентрация детергента превышает критическую концентрацию мицеллообразования, то детергент полностью солюбилизирует мембранные структуры. В противоположном случае (концентрация меньше ККМ) детергент модифицирует мембрану, не разрушая полностью липидный бислой. Кроме того, необходимо учитывать зависимость этого параметра от температуры и ионной силы среды. Детергенты с низкой ККМ, образующие крупные мицеллы, вследствие низкой концентрации мономеров не способны полностью удаляться при диализе или ультрафильтрации, что может привести к денатурации белка при накоплении молекул детергента. Поэтому удобнее пользоваться детергентами с высокими значениями ККМ (цвиттерионные детергенты, соли желчных кислот, октилглю-козид). Еще одной характеристикой детергента является его агрегационное число. Это количество молекул, входящих в состав одной мицеллы. Детергенты с высоким агрегационным числом образуют выраженные мицеллярные структуры, которые внедряются в липидный бислой и солюбилизируют его. Детергенты с низким агрегационным числом не способны образовывать собственные мицеллы и лишь встраиваются в бислой липидов.
Выбор детергента для выделения и очистки определенного мембранного белка осуществляется методом проб и ошибок, однако исследователи стремятся к использованию минимальных концентраций детергента с целью сохранения нативного структурно-функционального состояния изучаемого белка. Наиболее эффективными считают неионные детергенты (тритон Х-100, ок-тилглюкозид), соли желчных кислот (холат, дезоксихолат), цвиттерионные детергенты.
На рис. 60 приведены структурные формулы, а в табл. 18 описаны свойства некоторых детергентов, используемых для выделения и очистки мембранных белков. Необходимо отметить, что свойства растворов солей желчных кислот существенно зависят от температуры, pH, ионной силы. Эти соединения способны к образованию гелей при сдвиге pH на единицу выше рКа (для холата — 5,2, для дезоксихолата — 6,2).
Додецилсульфат натрия
О
