Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Для достижения максимума адсорбции следует взять отдельную колонию подходящих бактерий и инкубировать ее в L-буль-оне, содержащем 0,4% мальтозы, до тех пор, пока титр клеток не достигнет примерно 2,5-108 (поглощение при 650 нм примерно 0,5). Бактерии концентрируют низкоскоростным центрифугированием, ресуспендируют в 1/2—1/10 объема 10 мМ MgS04 и аэрируют встряхиванием при 37 °С в течение 1 ч. Голодную культуру, содержащую Mg2+, можно хранить несколько дней при 4°С, при этом титр жизнеспособных клеток почти не падает {следует учесть, что клетки Rec- не сохранятся).
Эффективная (>90%) адсорбция происходит при инкубации фага с клетками в течение 15 мин при комнатной температуре. При повышении температуры до 37°С ДНК быстро проникает
48
Глава 1
в клетку. Преадсорбция фага позволяет синхронизировать инфекцию и уменьшить разброс в размерах бляшек.
Суспензию фага обязательно следует развести, во-первых, для того, чтобы его можно было протитровать, а во-вторых, чтобы к бактериям можно было добавить заданное число фаговых частиц (даже единичная бляшка содержит 105—107 частиц фага). Концентрат фага можно разводить либо питательным бульоном, либо фаговым буфером (состав их приведен в разд. 18.1), хотя при длительном хранении бульон создает благоприятные условия для размножения посторонних микроорганизмов.
Для получения бляшек 0,1—0,2 мл суспензии бактерий (~109 клеток/мл) с адсорбированными на них фаговыми частицами смешивают с 2—3 мл расплавленного 0,65%-ного питательного агара (или агарозы), имеющего температуру 50°С. Смесь медленно выливают на чашку с нижним слоем питательного агара (1,5%) и, осторожно покачивая чашку, распределяют смесь так, чтобы она при застывании образовала ровный верхний слой. При использовании культуральных чашек другого размера следует соответственно изменить объем смеси. Как верхний, так и нижний слои агара следует заливать на строго горизонтальном столе, в противном случае как размер бляшек, так и их количество будут различаться на разных участках чашки. Чашки инкубируют вверх дном, чтобы конденсат не стекал на поверхность агара. Для проверки верхнего слоя на стерильность следует заливать контрольную чашку (без фага). Через 8—16 ч инкубации при 37 °С на мутном фоне бактериального газона появляются прозрачные фаговые бляшки (негативные колонии) диаметром 0,1—2 мм. В качестве верхнего слоя агарозу применяют только в тех случаях, когда необходимо снятие фильтров-реплик (разд. 9). Заливать агарозу несколько сложнее, так как она застывает быстрее агара. Чашки, хранившиеся в холодильнике, следует перед заливкой верхнего слоя подогреть до комнатной температуры.
Не следует заливать верхний агар, если нижний слой содержит избыточную влагу, так как бляшки в этом случае могут расползаться и даже смещаться, а слой верхнего агара при снятии реплик легче отстает от подложки. Во избежание этого чашки с нижним агаром следует подсушивать, выдерживая их в стерильных условиях со снятой крышкой до тех пор, пока на поверхности не появятся легкие морщины, либо заливать чашки за несколько дней до использования.
В общем случае любой фактор, увеличивающий время, необходимое для формирования сплошного газона бактерий, увеличивает и размер бляшек, так как бляшки перестают расти лишь после того, как образовался сплошной газон (т. е. по достижении клетками стационарной фазы). Бляшки будут больше, та-
Использование Х-векторов для конструирования библиотек ДНК
ким образом, на чашках с менее богатой средой либо при добавлении меньшего числа бактерий. Кроме того, бляшки большего размера образуются во влажной среде, т. е. при росте на-свежезалитых чашках, при невысокой концентрации нижнего агара или же в заполненном чашками влажном термостате-(а не в термальной комнате).
Для ограничения размера бляшек, что удобно для скрининга-библиотек при высокой плотности, подходит твердая и богатая: среда (например, агар на L-бульоне) для нижнего слоя и агароза на L-бульоне (0,65%) для верхнего слоя. С другой стороны, фаги redrgam~ (разд. 14) дают такие мелкие бляшки, в особенности на лизогенном по Р2 хозяине, что может оказаться необходимым увеличить их размер. Не так уж редко бывает,, что новичку вообще не удается обнаружить мельчайшие бляшки фага red~gam.-, если они росли при избытке клеток или на сухой богатой среде. В таких случаях используют более мягкую и бедную среду, например BBL-arap для нижнего слоя и верхний слой на основе BBL-триптиказы. Бляшки фага red~gam~ болыного размера можно получить на медленно растущих штаммах гесВС~, которые позволяют фагу реплицироваться по механизму «катящегося кольца», однако использование лизогенов-. Р2 в этих случаях невозможно.
Следует запомнить, что:
1. Даже самые мелкие бляшки содержат достаточное для; регистрации гибридизационными методами количество фаговой ДНК-
2. Хотя на газоне бактерий гесВС~ образуются крупные-бляшки, титр получающихся из них фаголизатов не всегда высок, поскольку при любом блокировании основных систем-генетической рекомбинации падает и выход фага. Для получения фагов red-gam~ в высоком титре как на чашках, так и в жидкой культуре лучше использовать в качестве хозяина ./?ес+-варианты Е. coli recBC~sbcA~ или recBC~sbcB~ (разд. 16.2).
