Жидкостная хроматография при высоких давлениях - Энгельгардт Х.
Скачать (прямая ссылка):
R - СООН <=* R - СОСГ + Н+
При добавлении кислоты или кислотного буфера равновесие сдвигается влево, диссоциация подавляется. Зоны элюирования при этом становятся острее и в крайнем случае имеют только небольшие хвосты. Подавить с помощью кислоты диссоциацию более кислых проб, которые и при pH 2 еще полностью диссоциированы, нельзя, в частности, и потому, что необходима специальная коррозионно-стойкая аппаратура. Подобные пробы почти не удерживаются, частично исключаются или вымываются в виде очень несимметричных пиков. Если добавить к элюенту подходящий противоион, например четвертичную аммониевую соль, то образуется соль органического основания карбоновой кислоты. Само собой разумеется, что коэффициент распределения у этой ионной пары иной, чем у свободной кио-лоты. Кроме стадии диссоциации карбоновой кислоты реакция образования ионной пары включает диссоциацию добавленного противоиона
r4nci*± r4n+ + сг
и образование ионной пары
R4N + + R - COO - * RCOO : NR4
Образование ионной пары зависит от pH неподвижной или подвижной фаз. Величина pH должна быть такой, чтобы проба и соединение, в которое входит противоион, были полностью диссоциированы. В качестве противоиона выбирают также соединения, которые полностью диссоциируют в широкой области pH; при этом можно подобрать оптимальное для разделения значение pH (диссоциация про-
Распределительная хроматография
175
бы). Обычно роль таких соединений играют сильные кислоты, например хлорная кислота, алкилсульфокислоты, и соли сильных оснований, например четвертичные аммониевые соли. Постоянное значение pH в области 2—8 поддерживают с помощью буферных растворов. При более низких и более высоких значениях pH следует опасаться коррозии аппаратуры, в частности коррозии фильтров, растворения силикагеля и т. д. Состояние равновесия и скорость образования ионной пары зависят от типа пробы, вида и концентрации протаю иона и значения pH. При этом оптимизировать разделение можно, меняя не только неподвижную фазу или полярность элюента, но и селективность (путем изменения температуры). Разделение оснований в принципе подчиняется тем же закономерностям.
На практике, по-видимому, осуществить разделение по методу ионных пар с использованием обратимых фаз проще, так как в этом случае противоион можно добавлять в элюент. Вводить необходимые противоионы в колонки, заполненные силикагелем с водой в качестве неподвижной фазы, труднее.
Биогенные амины и продукты обмена веществ [36, 45], фармацевтические препараты [37, 46], карбоновые кислоты [42], аскорбиновая кислота [43] и промежуточные продукты и красители [44] были разделены с помощью хроматографии ионных пар. В работе [47] даны подробные указания по практическому применению метода и перечислены реактивы, применяемые в хроматографии ионных пар на обращенных фазах.
3. Нанесение неподвижной фазы на носитель
В классическом варианте нанесения неподвижной фазы на носитель предполагается, что колонку заполняют сухим способом. Как правило, диаметр частиц насадки превышает 25 мкм. Разделяющую жидкость обычно наносят из раствора, после чего растворитель медленно удаляют испарением. Если хроматографическую колонку заполняют суспензией, то чаще всего разделительные жидкости удаляют из колонки или тем же растворителем, который использовался для приготовления суспензии, или подвижной фазой при кондиционировании колонки. Поэтому после заполнения таких колонок носителем на него необходимо нанести разделяющую жидкость.
Проще всего добавить небольшое количество неподвижной фазы в колонку, отмытую от элюента. Поскольку маленькие капельки неподвижной фазы проходят через колонку и осаждаются частично в детекторе, чтобы установилось стабильное соотношение, нужно очень много времени. Однако при этом распределение разделяющей жидкости на носителе может быть неоднородным. Более удобен опробованный уже в газовой хроматографии метод: раствор необходимой разделительной жидкости продавливают через колонку, после чего растворитель удаляют либо газом, например азотом [20], либо
176
Глава VII
элюентом [21]. Конечно, и в этом случае нельзя предсказать, сколько разделяющей жидкости удержится носителем.
Если носитель — активный твердый материал с большой у дельной.поверхностью, а подвижная фаза — полярная жидкость, то наносить жидкую фазу на носитель излишне. В этих случаях между разделяющей жидкостью, растворенной в элюенте и адсорбированной на активном носителе, устанавливается равновесие. Чем больше рг?зли-чие в полярностях неподвижной и подвижной фаз и чем больше удельная поверхность носителя, тем большее количество разделяющей жвдкости удерживает твердый носитель. Время, необходимое для установления равновесия, зависит главным образом от концентрации разделяющей жидкости в элюенте и от объемной скорости элюента. Целесообразно в сосуд для элюента добавить избыток неподвижной фазы и в процессе нанесения жидкой фазы заставлять элюент циркулировать. В качестве сосуда для предварительного кондиционирования элюента можно также использовать форколонку, заполненную хромосорбом с нанесенной на него выбранной разделяющей жидкостью. Форколонка должна содержать достаточный избыток разделяющей жидкости. Время, необходимое для нанесения неподвижной фазы, можно значительно сократить, повысив температуру в форколонке на 1-2°С по сравнению с разделительной колонкой.
