Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
образованием напряженной петли, чтобы белок агаС, находящийся в сайте 2,
мог взаимодействовать с другим белком, расположенным вблизи точки начала
транскрипции. Как показано на рис. 10-30, изменение на нецелое число
витков приведет к тому, что белок агаС окажется не с той стороны ДНК, и
для того, чтобы этот белок оказался в правильном положении, потребуется
еще полвитка ДНК. Хотя может показаться, что для ДНК не представляет
особой трудности закрутиться еще на полвитка, но в случае ДНК длиной 200
нуклеотидов для этого потребуется около 4 ккал/моль. Энергия связывания
при типичном взаимодействии ДНК-белок составляет лишь 10-15 ккал/моль.
Поскольку значительная часть этой энергии ушла бы на закручивание ДНК, то
вполне возможно, что в результате могло измениться тонко отрегулированное
взаимодействие, необходимое для репрессии.
Из других экспериментов следует, что агаС в сайте 2 может
взаимодействовать с агаС, расположенным в сайте 1, и образовывать при
этом петлю ДНК. В отсутствие арабйнозы гены araBAD полностью подавлены,
возможно, из-за того, что петля препятствует посадке РНК-полимеразы. Если
сайт связывания белка агаС делетирован (или белок агаС отсутствует
вследствие мутации), петля ДНК не может образоваться и связыванию РНК-
полимера-зы ничего не препятствует-в результате наблюдается 10-кратное
повышение уровня транскрипции кластера генов araBAD. В присутствии
арабйнозы (и в отсутствие глюкозы) белок агаС подвергается
конформационным изменениям, препятствующим образованию петли ДНК, что
также облегчает связывание РНК-полимеразы либо способствует ее
превращению в открытый комплекс, и в итоге транскрипция возрастает в 1000
раз.
Литература: Dunn, Т. М.; Hahn, S.; Ogden, S.; Schlief, R. F. An
operator at -280 base pairs that is required for repression of araBAD
operon promoter: addition of DNA helical turns between the operator and
promoter cyclically hinders repression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,
5017-5020, 1984.
10-11
А. Способность фактора транскрипции стимулировать транскрипцию в
ядерных экстрактах, начиная с делеции -61, но не с делеции -50, указывает
на то, что критически важная часть сайта связывания фактора лежит в
интервале между нуклеотидами -61 и -50, расположенными перед точкой
начала транскрипции. Сами по себе
Контроль генной экспрессии 413
исследования с помощью делеций не позволяют определить конец сайта
связывания, расположенный ближе всего к точке начала транскрипции,
поскольку удаление части этого сайта будет препятствовать связыванию
фактора. Однако эксперименты по футпринтингу ДНК свидетельствуют о том,
что на самом деле фактор защищает последовательность размером 12
нуклеотидов, от -63 до -52.
Б. На первый взгляд кажется противоречащим здравому смыслу, что
добавление стимулирующего фактора приводит к исчезновению из геля
транскриптов с матрицы, несущей делецию в положении -50. На самом деле
никакого противоречия нет: стимулирующий фактор приводит к десяти-
двадцатикратному повышению транскрипции со всех матриц, сохранивших
связывающую последовательность. Таким образом, уровень транскрипции с
матрицы, несущей делецию в положении - 50, снижается относительно
транскрипции со стимулированных матриц (и по этой причине полоса
транскрипта с матрицы, несущей делецию, становится настолько менее
интенсивной, что он кажется исчезнувшим).
В. Громадная разница в стабильности связывания фактора в присутствии и
в отсутствие TFIID позволяет предположить, что фактор связывается не
только с ДНК, но и с TFIID. Таким образом, в присутствии TFIID
стимулирующий фактор закрепляется на месте посредством двух
взаимодействий (с ДНК и с TFIID), тогда как в отсутствие TFIID его
связывание обусловлено одним типом взаимодействия (с ДНК).
Литература: Sawadogo, М.; Roeder, R.G. Interaction of a gene-
specific transcription factor with the adenovirus major late promoter
upstream of the TATA box region. Cell 43, 165-175, 1985.
10-12
A. Запаздывающие полосы расположены в полиакриламидном геле на разных
уровнях потому, что кодируемые кДНК белки имеют разные размеры. Поскольку
подвижность комплекса ДНК-белок зависит от суммарной мол. массы, то самый
короткий из связывающихся белков (кодируемый клоном 2 кДНК) замедляет
миграцию фрагмента ДНК в наименьшей степени, а самый длинный из
связывающихся белков (кодируемый клоном 4 кДНК)-в наибольшей.
Б. Поскольку продукты клонов 2, 3 и 4 кДНК тормозят движение в геле,
они должны кодировать домен связывания с энхансером. Слабое связывание
белка, кодируемого кДНК из клона 2, показывает, что в последовательности
мРНК отсутствует некоторая часть, необходимая для того, чтобы белок
нормально связывался. Белок, кодируемый кДНК клона 1, совсем не
связывается с энхансером, следовательно, в этом клоне не закодирован весь
связывающий домен. Таким образом, весьма важная часть связывающего домена
должна располагаться между 5'-концами клонов 1 и 2 кДНК. Эти опыты не
