Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
Трейером [138]. Исследовалось влияние ионной силы на специфическое и
обратимое связывание тяжелого меромиозина и миозинового субфрагмента 1 на
сефарозе с иммобилизованным G-актином. Комплексы, образуемые между
производными миозина и иммобилизованным G-актином, могут диссоциировать
при низких концентрациях АТР и ADP и пирофосфатов как в присутствии, так
и в отсутствие Mg2+. Кроме того, и связанный с сефарозой, и свободный G-
актин лишь немного увеличивают Л^2^-стимулируемую АТРазную активность
миозина. Такой подход позволяет решить вопрос, обязательно ли комплек-
сообразование между миозином и актином приводит к активации АТРазы.
Аффинная хроматография открывает также новые возможности для изучения
превращения протеинкиназы в форму, независящую от циклической АМР, путем
хроматографии на Ы6-капронил-3',5'-АМР-сефарозе [1286]. О'Карра и Берри
[853], используя сефарозу с присоединенным оксаматным производным,
доказали, что NADH индуцирует пируватсвязываюгций центр в
лактатдегидроге-назе, а также образование "абортивного" тройного
комплекса фермент-NADH-пнруват. Подобным образом аффинная хроматография
позволила [778] обнаружить комплексы фермент-реагент для
галактозилтрансферазы. Путем изучения влияния концентрации фосфата калия
на связывание а-изопропилмалатсинтетазы на L-лейцин-сефарозе найдено
[282-283], что высокие концентрации солей вызывают конформационные
изменения, затрагивающие лейцинсвязывающий центр. Подобные результаты
получены также для биосинтетической треониндезаминазы [931].
Фосфорилирова-ние сукцинил-СоА-синтетазы из каллуса соевых бобов
иммобилизованным аденозинтрифосфатом было изучено Видер де Ксифра и др.
[1273]. Чен [185] исследовал ренатурацию альдолазы, связанной с агарозой,
после денатурации 8 М мочевиной.
Примеры применения аффинной хроматографии
377
Аффинная хроматография применялась также для выделения ферментов,
участвующих в некоторых метаболических путях. Например, используя М-(о>-
аминогексил)-Ь-аспартат-сефарозу 6В, Тоса и др. [1183] выделили ферменты,
участвующие в метаболизме L-аспарагиновой кислоты (аспарагиназу,
аспартазу и аспартат-р-декарбоксилазу).
I
11.6. МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА ИНТЕРФЕРОНОВ ФИБРОБЛАСТОВ И ЛЕЙКОЦИТОВ,
ИССЛЕДОВАННАЯ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ С ЛЕКТИНАМИ И ГИДРОФОБНОЙ
ХРОМАТОГРАФИЕЙ
Интерфероны фибробластов и лейкоцитов человека, индуцируемые комплексом
полиинозиновой - полицитидиловой кислот и вирусом, различаются по своей
антигенности, Например, антитела, образуемые против интерферона
фибробластов, не способны нейтрализовать интерферон лейкоцитов. Антитела,
образуемые против препаратов интерферона лейкоцитов, обладают частично
перекрестной активностью к интерферону фибробластов, которая, однако,
может объясняться присутствием интерферонов фибробластного типа в этих
лейкоцитарных препаратах. Причины различий антигенного поведения могут
быть обусловлены первичными структурами полипептидных цепей и
лоеттрансляционными модификациями (гликозилированием) или и тем и другим.
Поскольку поверхность белка отражает его первичную структуру, а
гидрофобные аминокислоты на поверхности определяют взаимодействия с
гидрофобными сорбентами, Янковский и др. [580] решили сравнить поведение
обоих интерферонов при гидрофобной хроматографии различного типа. Обзор
данных о способности интерферонов лейкоцитов и фибробластов человека,
индуцируемых комплексом полиинозиновой и полицитидиловой кислот (г1п
гС"), а также вирусом ньюкестлской болезни связываться на различных
гидрофобных носителях, приведен в табл. 11.3 (системы А).
Хроматографическое поведение всех интерферонов исследовалось на сорбенте,
содержащем высокомолекулярный гидрофобный лиганд (бычий сывороточный
альбумин, иммобилизованный на бромцианактивирован-ной сефарозе 4В), и
двух сорбентах, модифицированных низкомолекулярными лигандами (СН-
сефароза 4В и АН-сефароза 4В),
Хроматография на альбумин - агарозе проводилась на колонках (20X0,9 см),
уравновешенных фосфатным буфером (0,02 М фосфат натрия, pH 7,4, 0,15 М
хлорид натрия) яри комнатной температуре. Образец интерферона (5 мл),
содержащий 125000 интерфероновых единиц (14 000 ед. в 1 мл образца),
наносился на колонку и колонка промывалась уравновешивающим буфером. В
первом пике элюировалась большая часть белка, но небольшая часть ин-
терфероновой активности. Активность элюировалась только при подаче на
колонку 0,02 М раствора фосфата натрия (pH 7,4), содержащего 1 моль/л
хлорида
Таблица 11.3
Связывание интерферонов лейкоцитов и фибробластов человека
иммобилизованными гидрофобными лигандами
н иммобилизованными лектинами
Специфичность по сахару Связывзнне8 интерферона, источником и
индуктором которого являются
Хроматографическая система лейкоциты, rVr9" лейкоциты, вирус
фибробласты, г1_-гС_ п п фибробл асты, вирус
А. Иммобилизованные гидрофобные лиганды
Бычий сывороточный альбумин-агароза - - - + +
СН-сефароза 4В - - - + +
АН-сефароза 4В - ± ± +
