Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
°С; для хранения раствор оставляют в пробирках на холоду. Перед
определением необходимое число пробирок промывают 0,9%-ным хлоридом
натрия, содержащим 0,05% твина 20. В каждую пробирку помещают 0,5 мл
одного из следующих растворов: I) стандартный раствор иммуноглобулина G,
2) неизвестный образец, 3) буферный раствор. После этого добавляют 0,1 мл
разбавленного конъюгата щелочной фосфатазы и иммуноглобулина G
(приготовленного с помощью сшивания глутаровым альдегидом). Для
разбавления используют фосфатный (солевой) буферный раствор, содержащий 1
% сывороточного альбумина человека и 0,02% азида натрия. Пробирки
инкубируют при комнатной температуре в течение ночи (16 ч) на роторной
мешалке так, чтобы поверхность, покрытая антителами, покрывалась 0,6 мл
раствора, находящегося в каждой пробирке. Затем пробирки промывают три
раза раствором NaCl-твин. Количество фермента, присоединенного к
иммуноглобулину G, связанному стенками пробирок, покрытых антителами,
определяют, добавляя 1 мл 0,05 М Na-карбонатного буфера (pH 9,8),
содержащего 1 мг/мл п-нитрофекилфосфата и 1 ммоль/л хлорида магния. Через
30 мин реакцию останавливают, добавляя 0,1 мл 1 М NaOH, Измеряют
оптическую плотность при 400 им и строят стандартный график зависимости
ферментативной активности (изменение оптической плотности в единицу
времени) индивидуальных образцов от содержания в иих иммуноглобулина G.
Энзимнммуноанализ для определения растворимых антигенов, имеющих по
меньшей мере два центра связывания антител, описан (Чайолини и Массейефом
[751]. Этот метод неконкурентного "сэндвича" состоит из трех стадий: 1)
определяемый антиген реагирует с покрытым антителами целлюлозным
иммуносорбентом; 2) меченные ферментом антитела инкубируют с антигеном,
связанным на твердой фазе; 3) затем измеряют ферментативную активность
иммуносорбента. В качестве примера применения этого метода может служить
определение а-фетопротеина. Использование ферментативного иммуноанализа
позволило Като и др. [619] определять такие небольшие количества
иммуноглобулина G человека, как 3 фмоль. Обзор, посвященный
количественному ферментативному иммуноанализу, опубликован Шарпе и др.
[1012].
* ЭЛИСА соответствует английскому сокращению ELISA (Enzyme-linked
immunosorbent assay).-Прим. перев.
Примеры применения аффинной хроматографии
383
11.7.3. Микрофлуориметрический иммуноанализ
Для того чтобы ликвидировать некоторые недостатки радио-иммуноанализа,
такие, как нестабильность радиоактивномеченных белков или денатурацию
белков при введении метки, Хайман и Бломмен [466] применили
флуоресцентную антисыворотку или антиген вместо радиоактивных. Они
изучили два типа флуоресцентного иммуноанализа: флуоресцентный
ингибиторный иммуноанализ и флуоресцентный иммуноконкурентный анализ.
Первый тип изучен с использованием иммуноглобулина G человека и
иммуноглобулина М мыши, а также последнего с овальбумином. В качестве
меток применялись флуоресцеин или тетраметилродаминизотиоциа-нат. Эти
методы были в десять раз менее чувствительными, чем радиоиммуноанализ.
Для изучения распределения столбнячных антител по классам
иммуноглобулинов был разработан простой иммунофлуоресцент-ный метод
[498].
0,02 мл суспензии антигена, содержащей 10 мг агарозы с иммобилизованный
токсином столбняка, смешивают с 0,2 мл разбавленной (обычно 1 : 10)
тестируемой сыворотки и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. После
троекратного промывания гранул геля вероналовым буфером (pH 7,2),
содержащим 1 моль/л хлорида натрия, добавляют 0,2 мл кроличьих антител к
человеческому иммуноглобулину М, А или G, затем инкубацию и промывку
повторяют. Наконец, добавляют 0,2 мл меченных флуоресцеином антител козы
к кроличьему иммуноглобулину и инкубацию и промывку повторяют. После
последней промывки осадок помещают на предметное стекло и рассматривают в
синем свете под флуоресцентным микроскопом. Присутствие специфических
антител обнаруживают по ярко-зеленому с флуоресцирующими краями
окрашиванию гранул геля.
11.8. СПЕЦИФИЧЕСКОЕ УДАЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К БЫЧЬЕМУ СЫВОРОТОЧНОМУ АЛЬБУМИНУ
(БСА)
IN VIVO С ПОМОЩЬЮ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ПРОТОКА ЧЕРЕЗ БСА, ИММОБИЛИЗОВАННЫЙ
НА НАНЛОНОВЫХ МИКРОКАПСУЛАХ
Доказано, что антитела и иммунные комплексы могут быть причиной некоторых
болезней. Терапия многих таких иммунологически обусловленных заболеваний
связана с использованием иммунодепрессантов, которые неспецифически
подавляют иммунную систему хозяина. Другим методом терапии может быть
специфическое удаление из кровообращения иммунных веществ, которые при
этой болезни и являются патологическими. Шенкейн и др. [1017] удаляли
антитела против БСА из плазмы положительно иммунизированных кроликов,
пропуская их кровь через иммуносорбент, приготовленный связыванием БСА с
бромацетилцеллюло-зой. Таким же способом специфически удаляли антитела к
ДНК из крови активно иммунизированных кроликов [1163, 1164]. Им-
384
Глава 11
муносорбенты для удаления антигенов сывороточного гепатита из крови,
