Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
гемоглобину. Несмотря на то что детально известна трехмерная структура
молекулы гемоглобина, очень мало имеется информации о структуре
гаптоглобина. В отношении связывающих участков известно, что тяжелые цепи
гаптоглобина содержат четыре связывающих центра, т. е. по паре центров на
каждый димер аф-гемоглобина, однако сродство к а-гемоглобиновой цепи
существенно выше, чем к р-цепи.
Изучение механизма взаимодействия между гаптоглобином человека,
ковалентно связанным с сефарозой 4В, и гемоглобином человека, а также а-
и p-цепями, обработанными п-хлормеркурибен-зоатом, проводилось двумя
способами: изучалось связывание с помощью хроматографии на колонке и
связывание a-цепей в равновесных условиях. ct+- и р^-Цепи - это цепи,
меченные ,4С с помощью н-хлормеркури-[14С]бензойной кислоты. Связывание
гемоглобина и а+- и р+-цепей на иммобилизованном гаптоглобине (38 нмоль
гаптоглобина на 1 мл сефарозы 4В) показано на рис. 11.3. Добавление
возрастающих количеств гемоглобина приводит к плато насыщения при 1,5
моль гемоглобина на 1 моль гаптоглобина. В этом отношении имеется отличие
от стехиометрии насыщенного комплекса гаптоглобина и гемоглобина в
растворе, соот-
24*
372
Глава 11
ветствующей 1 моль гемоглобина или 4 моль a-цепи на I моль гаптоглобина.
Для иммобилизованного гаптоглобина на 1 моль гаптоглобина связывается в
комплекс только 0,39 моль гемоглобина, Различия в связывающей емкости
объяснены Тсаписом и др. [1200] денатурацией гаптоглобина при его
присоединении к носителю, а также ухудшением пространственной доступности
связывающих центров гаптоглобина из-за его слишком близкого рас-
Рис. 11.3. Связывание гемоглобина человека (/) н модифицированных я-хлор-
меркурибензойной кислотой u-цепн (2) н р-цепл (3) гемоглобина на сефарозе
4В, замешенной гаптоглобиномг-i [1200].
Аликвоты (1 мл) наносились на колонку <1 мл) с сорбентом, избыток
несвязавшегося белка элюировался 100 мМ фосфатным буфером (pH 7.4),
содержащим 1 ммоль/л ЭДТА
положения к поверхности агарозы. Добавление а+-цепей в концентрациях,
близких к концентрациям добавлявшегося гемоглобина, приводит к меньшим
количествам связанных а+-цепей по сравнению с гемоглобином, а плато
насыщения не достигается даже при концентрации 0,60 ммоль/л. Связывание
р+-цепей настолько слабо, что может быть обнаружено только при высоких
концентрациях <0,50 и 0,73 ммоль/л). Из этих данных следует тот же ряд
аффинностей для иммобилизованного гаптоглобина, что и для свободного, а
именно гемоглобин>сс-цепь>(3-цепь,
По насыщению в равновесных условиях рассчитано связывание а4--цепей и
отсюда количество функционально активного гаптоглобина, равное 14,8 нмоль
на 1 мл колонки (0,39X38 нмоль). Распределение констант ассоциации Ki
выражается соотношением Скатчарда [1008]:
rlc=K-n-К-г (11.1)
Примеры применения аффинной хроматографии
373
где г - число молекул аффинного лиганда, связанных с функцио-нально
активными молекулами иммобилизованного гаптоглобина при концентрации с
аффинного лиганда в растворе, а п - максимальное число молекул аффинного
лиганда, которые могут быть связаны с молекулами гаптоглобина. График
Скатчарда для связывания 14С-меченых а4-цепей гаптоглобин- сефарозой 4В
приведен на рис. 11.4. В равновесных условиях опыты проводили следующим
образом: к 1 мл иммобилизованного гаптоглобина добавляли 1 мл раствора
14С-меченых а+-цепей. Концентрация аффинного лиганда (а+-цепей)
изменялась от 1,66 мкМ до 0,66 мМ.
После перемешивания в течение 30 мин при 4°С суспензии разделяли
центрифугированием в течение 10 мин (50 об/мин). Концентрацию а+-депей в
растворе определяли на основании измерений 14С-радиоактивности.
Количество связанных <х+-цепей рассчитывалось по разности общего
содержания добавленных а+-цепей и определенным в растворе количеством
свободных а+-цепей. Одновременно по связыванию таких же количеств
человеческого иммуноглобулина G на агарозе в тех же условиях определялись
поправки на неспецифическое связывание и включение жидкой фазы в матрицу.
В предположении, что константы ассоциации Ki подчиняются распределению
Сипсиана, коэффициент гетерогенности а центров связывания гаптоглобина
рассчитывался по уравнению
)="№+"!§с. (11.2)
Вычислено, что а=0,72, а средняя константа аффинности Ка = = 3,6-104
л/моль. Форма графика Скатчарда указывает ка гетерогенность связывающих
центров иммобилизованного гаптоглобина по связыванию a-цепей. Популяция
высокоаффинных центров с аффинной константой /Ci = 5,26-105 л/моль,
полученной экстраполяцией, мала, а число связывающих центров с низкой
аффинностью с константой /Сг = 6,23 -104 л/моль велико. Экстраполяция
графика до пересечения с осью г показала, что максимальное число центров
связывания "=4,3, а число высокоаффинных центров равно 1,5.
г
Рис. 11.4. Графики Скатчарда (основной рисунок) н Сипсиана (врезка)
связывания Г14С1а-цепи гемоглобина на гаптоглобин-сефарозе (см. рис.
11.3 и текст) [1200].
374
Глава II
