Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
Максимальное число центров связывания, найденное для иммобилизованного
гаптоглобина, согласуется с известным значением- четыре центра на 1
молекулу гаптоглобина в растворе. Следовательно, гаптоглобин,
присоединенный к агарозе, в целом обладает теми же свойствами по
связыванию гемоглобина и его а- и р-цепей, что и в растворе, и вследствие
этого пригоден для детального исследования механизма взаимодействия между
гаптоглобином н гемоглобином или его субъединицами.
Другие применения аффинной хроматографии включают изучение образования
комплексов карбоксипептидазы В с основными и ароматическими аналогами
аминокислот [П], определение стерических требований для связывания
субстрата антранилат-5-фос-форибозилпирофосфата фосфорибозилтрансферазой
на сефарозе с присоединенными производными антраниловой кислоты [761],
изучение гистон-гистонных взаимодействий [800], активного центра
трипсиногена [192], взаимодействия прогестерон-рецепторных комплексов с
нуклеотидами [816] и связывающих центров ацетил-холинэстерацы
млекопитающих [528].
11.5. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ
Для выяснения стадий реакции расщепления АТР, катализируемой миозином или
его ферментативно активными протеолитиче-скими фрагментами, Оплатка и др.
[873] .присоединили к сефарозе 2В через гидразид адипиновой кислоты
[у32Р] АТР, немеченые АТР, ADP или аденозин-5'-(р,уимино)трифосфат [AMP-
P(NH)P]. С помощью ферментативного гидролиза папаином они приготовили из
миозина ферментативно активный субфрагмент S-1 тяжелого меромиозина, этот
субфрагмент затем тринитрофенилировали. На рис, 11.5 показана
хроматография нативного и тринитрофенилиро-ванного тяжелого меромиозина
S-1 в присутствии либо Mg2*-, либо ЭДТА на колонках с АТР-агарозой, ADP-
агарозой и АМР- -P(NH)P - агарозой. Видно что во всех случаях, за
исключением колонок с АТР-агарозой, концентрация хлорида калия,
необходимая для элюирования в присутствии Mg2*, ^0,2 моль/л, а различия в
поведении нативного и тринитрофенилированного производного тяжелого
меромиозина S-1 незначительны. Для элюирования с колонок с ATP-агарозой в
присутствии Mg2* требовались более высокие концентрации хлорида калия, а
именно 0,5 моль/л для нативного и даже 1,6 моль/л для
тринитрофенилированного тяжелого меромиозина S-I. Так же соотносились
концентрации хлорида калия в элюенте при замене Mg2* на Са2+, только в
этом случае они были ниже. При всех условиях адсорбция обоих белков на
колонке с АМР-P(NH)P-агарозой была слабее, чем на колонках с АТР-агарозой
и ADP-агарозой, а в присутствии Mg2* (или
Примеры применения аффинной хроматографии
375
Са2+) активный белок лишь частично сорбировался. Неполная сорбция
наблюдалась также на сорбенте с присоединенным ADP в присутствии Са2+.
Следовательно, Mg2+ и Са2+ значительно повышают сродство миозина и его
производных к АТР-агарозе.
Мдг+ ЭДТА
Номер фракции
Рис. 11.5. Влияние Mg2+ на поведение тяжелого меромиозина S-1 (1) и
тринитрофенилированного тяжелого меромиозина S-1 (2) на колонках с АТР-
агарозой, АДР-агарозой и AMP-P(NH)P-агарозой [873].
6-10 мг белка наносились на колонки (130X9 мм), наполненные нуклеотид-
агарозой, предварительно уравновешенные 30 мМ .хлоридом калия, 10 м.М
имидазолом (pH 7) [или Обратным буфером (pH 8) в случае АТР-Р- (NH)P-
колонок] и 0,5 мМ ЭДТА+2 м.\1 MgJ+ (,") или I м.М ЭДТА (6). После
промывки уравновешивающим раствором накладывался градиент концентрации
хлорида калия (J), содержание других компонентов раствора не изменялось.
Объем фракции 2 мл. Заштрихованные области указывают отсутствие АТРазиой
активности.
Однако их присутствие не изменяет и даже слегка понижает (особенно Са2+)
сродство к ADP- и AMP-P(NH)P-агарозе. Двухвалентные катионы одновременно
ускоряют расщепление связанной молекулы АТР как нативным, так и
тринитрофенилированным тяжелым меромиозином S-1, что было показано
главным образом для агарозы с присоединенными молекулами [у-32Р] АТР.
Эти результаты послужили одним из важных оснований для предложения схемы
механизма расщепления АТР миозином. Оп-латка и др. [873] показали, что в
условиях, при которых расщеп-
376
Глава 11
ляется связанная молекула АТР, белок сорбируется не только на интактной
молекуле АТР, но также и на продуктах ее расщепления. Этот тип аффинной
хроматографии на иммобилизованном субстрате в условиях, благоприятных для
протекания ферментативной реакции, назван динамической аффинной
хроматографией. Высказано также предположение, что связывание ферментов в
этих условиях определяется скорее константой типа константы Ми-хаэлиса, а
не константой ассоциации фермента с интактным субстратом. Динамические
аффинные колонки, содержащие иммобилизованные субстраты, могут быть
безусловно полезными для обнаружения изменений в связывающих участках
активных центров ферментов и для разделения и выделения различных
изоферментов.
Взаимодействие между миозином и актином, на котором основано превращение
химической энергии в механическую энергию в мышце, изучено Боттомли и
