Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
активности нативного фермента (15 800 ед./ /мкмоль), и ее трехмерная
структура близка структуре нуклеазы. Такие же результаты были получены
даже при замене нативного фрагмента нуклеаза-Т-(6-48) аналогичным
пептидом, синтезированным по методу Меррифилда. Аффинная хроматография
вновь оказалась весьма полезной и для очистки этого синтетического 42-
членного пептида. Синтетический продукт очищался на сефарозе с
присоединенным фрагментом нуклеаза-Т-(49-149). Прежде всего
предварительно небольшие количества нативного фрагмента нуклеаза-Т-(6-48)
хроматографировались на этой же колонке. Сорбция происходила при pH 8 в
присутствии хлорида кальция и pdTp (необходимых для стабилизации
комплекса). Нативный фрагмент затем элюировался разбавленной уксусной
кислотой (pH 3), т. е. в условиях, когда комплекс диссоциирует. Согласно
предва-
24-6
370
Глава II
рительным результатам, предложена следующая методика очистки
синтетического фрагмента. На колонку (5X1 см) наносили 5 мг
синтетического пептида в 0,05 М боратном буфере (pH 8), содержащем 0,01
моль/л хлорида кальция и 0,001 моль/л pdTp. При промывании исходным
буфером элюировалось некоторое количество пептида, имеющего состав и
подвижность при диск-электрофорезе нативного пептида-(6-48). Однако этот
элюируемый пептид не сорбировался на колонке даже при повторной
хроматографии. Около 7% общего количества нанесенного синтетического
пептида элюировалось 0,001 М уксусной кислотой (pH 3). Эта часть не
отличалась существенно по своему аминокислотному составу от исходного
материала. Пептидный фрагмент, содержащийся в элюате, затем использовался
для комплементарного комплексообразо-вания с фрагментами нуклеаза-Т-(49-
149) для полной замены нативного пептида. Таким образом была получена
полусинтетическая нуклеаза.
Еще одним примером продуктивного комплементарного комп-лексообразования
является комплекс двух других фрагментов той же нуклеазы, а именно
комплекс, образованный нуклеазой-(1 - 126), приготовленной ограниченным
триптическим гидролизом трифторацетилированной нуклеазы, и бромциановым
фрагментом нуклеазы-(99-149). Этот комплекс обладает 10-12%
ферментативной активности нативной нуклеазы [1154]. Оба упомянутые
комплексы связывались с pdTp-сефарозой.
На pdTp-сефарозе была связана смесь трех фрагментов: 0,085 мкмоль
нуклеазы-Т-(6-48), 0,060 мкмоль нуклеазы-Т-(49, 50-126) [нуклеаза-Т-(49,
50-126) представляет собой смесь пептидов - нуклеазы-Т-(49-126) и
нуклеазы-Т-(50- 126)], 0,067 мкмоль нуклеазы-(99-149) в присутствии 0,01
моль/л хлорида кальция в 0,2 мл 0,1 М ацетата аммония (pH 8) при 4, 10,
15 и 20°С наносились на колонку (4X1 см) с pdTp-сефарозой [32].
Количество комплекса, элюируемого 0,1 М уксусной кислотой, сильно зависит
от температуры; оно максимально при 4°С и снижается с повышением
температуры (см. рис. 10.1). На основании аминокислотного анализа и
двумерных пептидных карт триптического гидролизата показано, что
элюируемый комплекс состоит из эквимолярных количеств нуклеазы-Т-(6-48),
нуклеазы-Т-(49, 50- 126) и нуклеазы-(99-149). Удельная активность
комплекса 15,3 ед./мкмоль. Уменьшение сорбции комплекса, наблюдаемое при
росте температуры, может объясняться ухудшением комплек-собразования или
снижением сродства аффинного лиганда к комплексу, которое обусловлено
термической неустойчивостью ферментативной активности трехфрагментного
комплекса. При аффинной хроматографии любой комбинации двух из трех
упомянутых выше фрагментов не происходит существенной сорбции даже при
4°С. При этой температуре не наблюдалась также сорбция трех фраг-
Примеры применения аффинной хроматографии
371
ментов в отсутствие хлорида кальция или при нанесении смеси фрагментов
нуклеазы-{ 1-120) и нуклеазы-(127-149).
Эти результаты показывают, что аффинная хроматография может стать также
важным методом изучения комплементарного образования комплексов пептидных
фрагментов активных белков, приготовленных путем выделения из природного
материала или синтетически.
11.4. ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Использование аффинной хроматографии для определения констант диссоциации
двойных комплексов дегидрогеназ и NADH рассматривалось в гл. 2, Этот
метод был недавно разработан Броде-лиусом и Мосбахом [151].
Определение констант диссоциации на основе объемов элюирования фермента,
освобождающегося из колонки с иммобилизованным ингибитором при изменении
концентрации растворов свободного ингибитора, детально обсуждается в гл.
4 на примере изучения взаимодействия олигоадениловой кислоты с
иммобилизованной полиуридиловой кислотой .путем анализа кривых
элюирования или взаимодействия нуклеотидов с пептидами с помощью
матричной хроматографии. Другой пример - изучение взаимодействий
гемоглобина (человека) и его полипептидных цепей с гаптоглобу-лином,
связанным с агарозной матрицей [1200]. Гаптоглобулины (аг-гликопротеины
плазмы крови многих видов животных) обладают высоким сродством к
