Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
соединений, как это представлено в обзорной табл. 11.1. Наряду с
названием выделяемого вещества в таблице приведены также используемые
аффинные лиганды, нерастворимые носители и пространственные группы,
причем указано, аффинный лиганд или нерастворимая матрица модифицированы
данной пространственной группой. Обзорная таблица включает выделения
веществ как с помощью типичной биоаффинной хроматографии, так и с помощью
гидрофобной или ковалентной хроматографии.
Разнообразие условий выделения обусловлено природой выделяемых веществ.
Хотя иногда вещество в гомогенном виде выделялось из сырого материала с
помощью только хроматографии, значительно чаще встречаются случаи, когда
для очистки необходима комбинация аффинной хроматографии с другими
методами. Принципы, обязательные для успешной очистки и выделения
вещества, в общем виде детально рассмотрены в гл. 5 и 10, и, опираясь на
них, следует подбирать условия выделения для каждого конкретного случая.
Для того чтобы читателя информировать об индивидуальных аффинных
лигандах, которые были использованы, или о промышленно выпускаемых
иммобилизованных аффинных лигандах, во всех случаях приведены
коммерческие названия, если они были опубликованы. Эти иммобилизованные
лиганды приведены в табл. 11.2, где указаны также их химическая природа и
фирма-изготовитель.
11.2. РАЗДЕЛЕНИЕ D, L-ТРИПТОФАНА АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ НА КОЛОНКЕ С
ИММОБИЛИЗОВАННЫМ НА АГАРОЗЕ БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ
Найдено, что некоторые оптические изомеры по-разному связываются
сывороточными белками. Так, наблюдается различное связывание D- и L-
изомеров 0,Ь-триптофана бычьим сывороточным альбумином [783] и 0,Ь-
альдостерона кортикостероидсвязываю-щим глобулином [1220]. Стюарт и
Догерти [1122] применили аффинную хроматографию для разделения 0,1.-
триптофана с помощью бычьего сывороточного альбумина на агарозе.
368
Глава 11
Колоночная хроматография с использованием иммобилизованного бычьего
сывороточного альбумина, присоединенного непосредственно к сефарозе 4В,
сывороточного альбумина, присоединенного к сукциниламинозтнлагарозе, или
обезжиренного сывороточного альбумина (по методу Чена [195]),
присоединенного также к
Рис. ILL Хроматография D*L-триптофана на препарате обезжиренный бычий
сывороточный альбумин-сукцшшламиноэтнлагароза (250x9 мм) [1122].
D.L Триптофан (500 нмоль), растворенный в 0Л мл 0,1 М боратного буфера
(pH 9,2), содер* жащсго I об. % диметилсульфоксида, наносился на колонку
(содержащую 630 нмоль бычьего сывороточного альбумина). Колонка
элюировалась со скоростью 30 мл/ч боратным буфером (без
диметилсульфоксида) (пробы отбирались в 20 пробирок), а эагем 0,1 М
уксусной кислотой. Свободный объем был определен по элюированию
диметилсульфоксида.
сукциниламиноэтилагарозе, привела к наилучшим результатам только в
.последнем случае. Ход хроматографического разделения иллюстрирует рис.
11.1. Показано, что боратным буфером элюируется только D-триптофан, в то
время как уксусной кислотой только L-триптофан. Аффинная хроматография,
по-видимому, может быть применена для аналогичного разделения и других
энантио-мерных пар.
11.3. ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКАЯ НУКЛЕАЗА И КОМПЛЕМЕНТАРНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ
НУКЛЕОТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ
Стафилококковая нуклеаза - фермент, исследованный с помощью аффинной
хроматографии наиболее широко. Успешное выделение нуклеазы на сефарозе с
присоединенным 3-(4-аминофе-
Примеры применения аффинной хроматографии
369
нилфосфорил)дезокситимидин-5'-фосфатом (pdTp-сефарозе) описано еше в 1968
г. [248]. Используя хроматографию триптического гидролизата нуклеазы,
меченной (дезокситимидин-3',5'-дифосфат-аминофенил) дезокситимидин-3-
[14С]бромацетил-п-аминофенилфос-фатом на сефарозе с присоединенной
нуклеазой, Вилчек [1277] получил пептиды активного центра фермента.
Проведя триптический гидролиз нуклеазы в присутствии Са2+ и нуклеозид-
3',5'-дезокситимидиндифосфата (pdTp), Онтьес и Ан-
f a 3S я & ямищ w
Иухлеаза
49 №9
6 48
49 /26
99 /49
/ 126
Иухлеаза-Т-(49 -149)
Иухлеаза -Т- (6-48)
Иухлеаза - Т- (49-/26)
Иухлеаза - (99-/49)
Иухлеаза - (/-126)
/г? ка
Иухлеаза - (/27-/49) '----- '
Рис. П.2. Диаграмма линейной зависимости между аминокислотными
последовательностями нуклеазы и ее фрагментами, которые дают продуктивную
ком-плементарность. Рентгеноструктурнымн исследованиями были показаны p-
структура между остатками 12 и 35 и три а-спиральиых участка между
остатками 55 и 67. 99 и 106, а также 122 и 133, которые отмечены на
рисунке. Нуклеаза-(127-149) не связывается с нуклеазой-(1-126) [32],
финсен [871, 872] получили три фрагмента: пентапептид и два по-
липептидных фрагмента - нуклеаза-Т-(6-48) и нуклеаза-Т-(49- 149) (рис.
11.2). Последние (оба фрагмента) были неактивными и
не имели упорядоченной структуры, будучи взятыми в отдельности, но они
обратимо ассоциировали с образованием нековалентно связанного комплекса,
названного нуклеазой-Т'. Нуклеаза-Т' обладает 8% (1620 ед./мкмоль)
