Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
Б. Иммобилизованные лектины
Из подковообразного краба N-Ацетилнейраминовая кислота - - +
+
Из Lotus L-Фукоза - - ± +
Конканавалин А L-Манноза - - + +
Из Bandeiraea simpiici folia а- и p-D-Галактоза - - - -
Лектин соевых бобов N-Ацетилгалактозамин - - - -
Лектин зародышей пшеницы N-Ацетилглюкозамин
а -I-полное связывание; ±-частичное связывание; - - отсутствие
связывания.
Примеры применения аффинной хроматографии
379
натрия и 33 об.% этиленкликаля. Собирали фракции по 1,3 мл при скорости
потока 30 мл-см_2-ч_| [545].
Хроматография интерферона на СН-сефарозе [580]. Диализ интерферона фи-
бробластов против фосфатного (солевого) буфера проводился в течение 16 ч
при 4°С, затем 1 мл образца, содержащего 12 000 интерфероновых единиц,
наносился прн комнатной температуре на Колонку (20X0,9 см),
уравновешенную раствором, в котором проводился диализ. Этим буферным
раствором элюировалась белковая фракция без иитерфероновой активности; ОI
500 ед. интерферона элюировались 0,02 М фосфатным буфером (pH 7,4),
содержащим 1 мо.н./л хлорида натрня и 50 об.% этиленглнколя. Диализ
интерферона лейкоцитов проводился против 0,02 М фосфатного буфера (pH
7,4), при 4 °С в течение 16 ч. 8 мл образца, содержащих 4800 ед.
иитерфероновой активности, наносились на колонку (20X0,9 см),
уравновешенную тем же буфером при комнаткой температуре. В первом пике,
элюируемом уравновешивающим буфером, элюируется 97% нанесенного белка и
83% нанесенной активности. Пропускание через колонку 0,02 М фосфатного
буфера (pH 7,4), содержащего 0,15 моль/л хлорида натрия, затем того же
буфера, содержащего I моль/л хлорида натрия, и, наконец, последнего
раствора, в который добавлено 50 об.% этиленкликоля, не приводит к
дальнейшему элюированию интерферойОвой активности.
Хроматография на АН-сефарозе проводилась подобным образом. Такой же
образец интерферона фибробластов (12 000 ед.) наносился на колонку
(20X0,9 см), уравновешенную фосфатным (солевым) буферным раствором при
комнатной температуре. Первый пик содержал 100% нанесенного белка и 72%
нанесенной иитерфероновой активности. Остающаяся активность белка
элюирована 0,02 М фосфатным буфером (pH 7,4), содержащим 1 моль/л хлорида
натрия. 2,5 мл днализованного раствора интерферона лейкоцитов (2750 ед.)
наносились на колонку (15X0,9 см), уравновешенную фосфатным (солевым)
буферным раствором при комнатной температуре. Первая фракция содержала
половину от 73% полученной с колонки иитерфероновой активности и 81%
нанесенного белка. Остальная активность элюировалась 0,02 М фосфатным
буфером (pH 7,4), содержащим 1 моль/л хлорида натрия. Из приведенных
результатов следует, что интерферон фибробластов более гидрофобен, чем
интерферон лейкоцитов.
Для сопоставления посттрансляционной модификации интерфе-
ронов Янковский и др. [580] характеризовали оба интерферона по их
способности связываться с различными иммобилизованными лектинами. Эти
результаты суммированы в табл. 11.3 системы Б. По отсутствию способности
интерферонов лейкоцитов человека связываться с лектинами, различающими
как концевые остатки сахаров (подковообразный краб, Lotus, Bandeiraea),
так и внутренние остатки (зародыши пшеницы, соевые бобы, конканавалин А),
можно прийти к заключению, что таких остатков сахаров в интерфероне нет.
Следовательно, может быть сделан вывод о том, что этот интерферон не
является гликопротеином. Напротив, интерферон фибробластов человека
является гликопротеином. На основе связывания с лектином подковообразного
краба можно предположить, что он содержит остаток сиаловой кислоты. Кроме
того, имеется L-фукоза в форме, доступной для связывания специфическими
лектинами.
Из данных, приведенных в табл. 11.3, следует, что различия в молекулярных
структурах, по-видимому, могут быть обусловлены главным образом типом
клеток, в которых индуцируется синтез интерферона. Различия, основанные
на индукционном сигнале (ви-
380
Глава 11
рус или rln-rCn) в одинаковых клетках, вероятно, выражены значительно
слабее.
Аффинная хроматография была применена также для обнаружения структурных
различий [280]. На специфических иммуносорбентах установлены структурные
различия между ядерной и митохондриальной глутаматдегидрогеназами. Уаймен
и Уоллен [1290] с помощью аффинной хроматографии исследовали соотношения
между структурами "глутаминовой" (А) и "лизиновой" (В) форм плазминогена
человека и их взаимодействие с N-концевым активационным пептидом. N-
Концевой активационный пептид хроматографировали на сефарозе с ковалентно
связанным плазмино-геном В; 1,0 мкмоль иммобилизованного плазминогена В
сорбировал 0,27 мкмоль этого пептида. Адсорбированный пептид мог быть
элюирован буфером, содержащим 0,005 моль/л е-аминокапроновой кислоты.
Вывод о ее специфическом действии следует из использования для
элюирования достаточно низкой концентрацией. При нанесении N-концевого
активационного пептида на сефарозу с присоединенным плазминогеном А
