Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
274
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ, СВЯЗАННЫЕ С ИММОРТАЛИЗАЦИЕЙ
Исследование механизмов иммортализации клеток человека представляется весьма существенным для понимания как процессов старения, так и злокачественной трансформации. Однако молекулярные механизмы иммортализации до сих пор остаются неясными. Со времени появления сообщения Хейфлика об ограниченности способности нормальных клеток к размножению многие исследователи стремятся найти и понять механизм предполагаемого счетчика, определяющего этот лимит, и того способа, которым иммортализованные клетки обходят это ограничение. В 1971 г. А.М. Оловников, исходя из теоретических предпосылок, предположил, что клетка может стареть в связи с потерей повторяющихся последовательностей ДНК на концах хромосом из-за их концевой недорепликации (Оловников, 1971; Olovnikov, 1973а, Olovnikov, 1996b). Существование самого процесса недорепликации независимо предположил также Д. Уотсон в 1972 г. Через два десятилетия после того, как Оловников предложил теорию мар-гинотомии, Харли и-сотрудники обнаружили, что потеря теломерной ДНК в результате деления клеток может быть фактором их старения (Harley et al., 1990, Harley, 1991, Harley et al., 1992). Теломерная гипотеза (рис. 97) предполагает, что потеря теломер играет роль митотических часов, которые отсчитывают число клеточных делений. По достижении критической длины теломерной ДНК запускаются процессы остановки клеточного цикла.
После трансфекции клеток Т-антигеном SV40 клетки избегают старения и продолжают терять теломерную ДНК до тех пор, пока не наступит состояние кризиса. Преодоление кризиса связано со стабилизацией теломер и экспрессией теломеразы (Counter et al., 1992) - рибонуклеопротеидной обратной транскриптазы, способной удлинять теломеры in v\yo (Morin, 1989). Показано, что теломераза активирована в большинстве исследованных иммортализованных линий клеток и в первичных опухолях, но не в нормальных клетках (Kim et al., 1994). Поэтому экспрессию теломеразы считают необходимым фактором иммортализации клеток. Однако недавнее обнаружение посткризисных клеток и линий опухолевых клеток, не экспрессирующих теломеразу, но поддерживающих длину теломер через альтернативный механизм (Bryan et al., 1995; Rogan et al., 1995), показало, что выживание клеток возможно и без теломеразы.
Нашлись и другие генетические изменения, сопровождающие блокировку программы старения или кризиса (Спитковский, 1997). Некоторые из этих изменений могут быть необходимы для дерепрессии одного или нескольких механизмов поддержания теломер, а некоторые могут быть следствием изменений теломер, тогда как другие не связаны с необходимостью поддержания теломер. Показано (Cristofalo et al., 1992; Meyyappan et al.,
1996), что экспрессия многих генов изменяется после начала старения клеток и при иммортализации. В настоящее время неизвестно, какие из этих изменений первичны, а какие вторичны. Дункан (1997) приводит примеры некоторых генов, изменивших характер экспрессии после иммортализации: прохибитин - известный супрессор роста; 06-метичгуанин ДНК-метил-трансфераза - фермент репарации ДНК; стауроспорин - ингибитор гроте инкиназ; морталин - кодирует белок, подавляющий пролиферацию клеток; некоторые гены, кодирующие белки цитоскелета. В свете полученных ре-
275
(1) Половые клетки: теломераза включена, теломеры неизменны
-1\ (5) Иммортализованные клетки:
- (3) Увеличение \ теломераза включена,
_ продолжительности \ теломеры неизменны
(2) Соматические клетки: теломераза выключена, теломеры укорочены
2
(4) Кризис
СТАРЕНИЕ КРИЗИС КЛЕТОЧНОЕ ДЕЛЕНИЕ
Рис. 97. Теломерная гипотеза клеточного старения и иммортализации (Greider C.W. Current Biology. 1998. Vol. 8. P. 178-181)
зультатов и исходя из выше изложенных предпосылок было интересно выявить гены, которые в процессе 8У40-индуцированной иммортализации подверглись перестройкам, либо изменили уровень своей экспрессии. Проводя сравнительный анализ уровня экспрессии митохондриальных генов окислительного фосфорилирования в иммортализованных клетках и в разных типах лимфом (Николаев и др., 2001), было обнаружено, что в иммортализованных клетках наблюдается усиление экспрессии двух митохондриальных генов, участвующих в окислительном фосфорилировании - гена цитохром-с-оксидазы 2 и гена НАДН-дегидрогеназы 4, а также впервые показано усиление экспрессии онкогена set в этих клетках (Николаев и др., 1999).
ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ МОДЕЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР,
ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ РАЗЛИЧНЫЕ ФОРМЫ
ГЕНА ПРЕСЕНИЛИНА-1 ЧЕЛОВЕКА
Настоящая работа по изучению влияния ранее не исследованных мутаций в гене hpsl на фундаментальные клеточные процессы, была проведена на модельных трансфицированных культурах, которые были созданы на основе линии клеток феохромоцитомы крысы PC 12. Данные клетки являются удобной и широко используемой моделью для изучения процессов нейрональной дифференцировки и клеточной гибели, поскольку под действием фактора роста нервов (NGF), добавляемого в культуральную среду, они приобретают нейроноподобный фенотип.
Трансфекция клеток PC 12 методом электропорации была проведена вектором pcDNA3 (несущим селективный ген резистентности к неомицину пеог, позволяющий отбирать стабильные трансфектанты на среде с антибиотиком G418) и плазмидами, сконструированными на его основе. Данные
