Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Свердлов Е.Д. -> "Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1" -> 142

Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.

Свердлов Е.Д. Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 — М.: Наука, 2003. — 372 c.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка): perspektivimoleculyargenetiki2003.djvu
Предыдущая << 1 .. 136 137 138 139 140 141 < 142 > 143 144 145 146 147 148 .. 199 >> Следующая

Настоящая работа по изучению влияния ранее не исследованных мутаций в гене hpsl на фундаментальные клеточные процессы, была проведена на модельных трансфицированных культурах, которые были созданы на основе линии клеток феохромоцитомы крысы РС12. Основные результаты, полученные в ходе выполнения этой работы представлены в соответствующем подразделе раздела “Основная часть”.
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
МУТАГЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ АКТИВИРОВАННЫХ
КЛЕТОЧНЫХ ОНКОГЕНОВ
Основной целью исследований явилось изучение мутагенного эффекта активированных клеточных онкогенов c-Ha-rasl, выделенного из клеток EJ карциномы мочевого пузыря человека и с-тус, выделенного из плазмоцито-мы мыши МОРС 315.
Работу проводили на клетках клона спонтанно трансформированной линии фибробластов китайского хомячка. Были использованы плазмиды pEJ6.6, содержащая онкоген c-Ha-rasl, и pSVc-myc-1 (Shih, Weinberg, 1982; Land, 1983). Модельной системой служил ген hprt, кодирующий фермент ги-поксантин- фосфорибозилтрансферазу (ГФРТ), мутации которого определяют резистентность к аналогам пуриновых оснований 6-тиогуанину (6-ТГ) и 6-меркаптопурину (6-МП).
А. Мутагенная активность плазмид pEJ6.6 и pSVc-myc-1. Прежде чем исследовать мутагенный потенциал плазмид, необходимо было убедиться, что их ДНК обладает биологической активностью, т.е. что встроенные в плазмиды онкогены способны индуцировать злокачественную трансформацию. С этой целью проводили трансфекцию псевдонормальных крысиных клеток Rat2 плазмидой pEJ 6.6 и плазмидой pSVc-myc-1. Было показано, что после трансфекции в клетках Rat2 возникают многослойные фокусы морфологической трансформации с частотой 1СН, в то время как контрольные плазмиды pBR322 и pSV2-neo, на основе которых были сконструированы соответственно плазмиды pEJ6.6 и pSVc-myc-1, не вызывали образования фокусов (рис. 93).
263
При исследовании мутагенного действия плазмиды pEJ6.6 после трансфекции наблюдалось заметное увеличение частоты мутантов ГФРТ , резистентных к аналогам пуриновых оснований, в среднем в 2,6 раза по сравнению с контролем (pBR 322). Анализ всей совокупности данных по критерию Вилкоксона (6 опытов) позволяет сделать вывод о достоверности наблюдаемой индукции генных мутаций (Р < 0,05) (Барон и др., 1992). Аналогичные результаты были получены и при изучении индукции хромосомных аберраций. Плазмида pEJ6.6 повышала частоту хромосомных аберраций и частоту разрывов на клетку по сравнению с контролем (Барон и др., 1992). Мутагенным эффектом обладала и плазмида, несущая онкоген с-тус (pSVc-myc-1), которая в такой же степени, как плазмида pEJ6.6, повышала частоту генных мутаций (7 опытов, Р < 0,05) и хромосомных аберраций (Бобрышева и др.,
1993).
Б. Роль активированного клеточного онкогена c-Ha-rasl в мутагенном эффекте плазмиды pEJb.6. Результаты опытов с плазмидой pEJ6.6 не позволяли, однако, исключить возможность определенного вклада в наблюдаемый мутагенный эффект не только действия онкогена, но и каких-то других последовательностей в составе плазмиды pEJ6.6. С целью выяснения этого вопроса, была сконструирована плазмида pEJdl, в которой онкоген инактивировали за счет делеции (~0,3 т.п.н.), включающей первый интрон и затрагивающей границы первого и второго экзонов. В отличие от плазмиды с активным онкогеном плазмида pEJdl не вызывала появления многослойных фокусов трансформации. Следовательно, делеция инактивировала онкоген, и плазмида pEJdl могла быть использована в качестве контроля для оценки роли онкогена c-Ha-rasl в мутагенном эффекте плазмиды pEJ6.6.
Полученные данные показали (6 опытов), что частота мутантов ГФРТ, возникших после трансфекции плазмиды рЕГб.б с активным онкогеном, в 1,6 раза достоверна (Р < 0,05) превышала их частоту в контроле (pEJdl) (Baron et al., 1992).
В. Характеристика мутантов, индуцированных онкогеном c-Ha-rasl, и природа мутагенного действия онкогена. В дальнейшем представлялось необходимым выделить индуцированные онкогеном резистентные мутанты ГФРТ- и проверить степень стабильности признака резистентности, что в генетике соматических клеток рассматривается как тест, подтверждающий его мутационную природу. При изоляции клонов, резистентных к 6-МП и 6-ТГ, важно было применить методику, которая с высокой долей вероятности позволяла бы утверждать, что резистентные клоны были индуцированы онкогеном, а не являются спонтанными мутантами, присутствующими в популяции. С этой целью была использована специальная методика (флуктуа-ционный тест), которая позволяла исключить возможность появления резистентных колоний в контроле, т.е. фон спонтанных мутантов в контроле был нулевым.
Была проверена степень стабильности признака резистентности при длительном культивировании в неселективных условиях, т.е. в отсутствие давления отбора по селективному признаку. Последующий перевод в селективные условия показал, что все клоны сохраняли резистентность и были способны к росту как в массовом, так и в разреженном посеве, что подтвердило их мутационную природу. Тем не менее степень резистентности клонов значительно варьировала, что указывало на возможность сохранения у не-
Предыдущая << 1 .. 136 137 138 139 140 141 < 142 > 143 144 145 146 147 148 .. 199 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed