Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
268
Снижение зависимости роста клеток от сыворотки Рост в агаре Контактное торможение Прививае- мость Кариотип Авторы
6 7 8 9 10 11
Ни + Ни - Анеупл. Berry et al., 1988
+ + - - Ни Miranda et al., 1983
+ — Ни — Анеупл* Wynford-Thomas et al., 1990
Ни - Ни - Анеупл. Rhim et al., 1985
Ни + — — Ни Dorman et al., 1983
+ - - Ни Ни Major et al., 1985
— + — — Анеупл. Namba et al., 1986
Ни + — — Анеупл. Kakunaga et al., 1978
+ + Ни Ни Ни Daga-Grosjean et al., 1987
+ — — Ни Ни Балабанов и др., 1990
+ — Ни Гетероплоид Иноземцева и др., 2001
+ Ни Ни Анеупл. Иноземцева и др., 1997, 2001
среде, содержащей антибиотик генетицин (G 418). О приобретении клетками признака бессмертия можно судить либо по их способности к длительному культивированию, либо по способности к клонированию и субклонированию. Иммортализованные клетки, полученные в результате воздействия tsA мутанта SV40, способны к длительному культивированию и ведутся нами в культуре более 2 лет. А клетки, полученные в результате трансфекции плазмидой pSV3neo, пассируются в культуре более 60 пассажей и способны к субклонированию, что позволяет их считать условно иммортализованными.
В результате проведенной серии экспериментов каждому коллективу удалось получить по одной иммортализованной линии фибробластов человека. Показано, что индуцированная частота иммортализации равна 1 х 10~7, что сопоставимо с данными, известными в литературе (Маупе et al., 1986; McCormick et al., 1988; Shay et al., 1989; Wright, Shay, 1992). Райнехарт (Rinehart et al., 1993) отмечает, что разные типы клеток могут иммортализо-ваться с различной частотой от 1 х 10-6 для эндометриальных стромальных клеток до 3 х 10 7 для фибробластов.
Одной из особенностей процесса иммортализации клеток человека является наличие или отсутствие состояния кризиса. Впервые состояние кризиса
269
было описано в 1965 г. в результате исследования эффектов вируса SV40 на фибробласты человека (Girardi et al., 1965). Многие авторы (Wright et al., 1989; Bischoff et al., 1990; Rinehart et al., 1993; Дункан, 1997; Спитковский, 1997) указывают на то, что иммортализация клеток человека под действием SV40 чаще всего протекает в две стадии. Первая стадия - временное удлинение жизни: после введения в клетки последовательности ДНК, кодирующей ранние белки вируса SV40, такие как большой Т-антиген и другие онкобелки, нормальные клетки человека претерпевают “морфологическую трансформацию” и продолжительность их жизни по сравнению с исходными клетками увеличивается в среднем на 40 удвоений популяции. Затем эти клетки обычно приходят к состоянию кризиса, т.е. к прекращению деления и гибели части клеток популяции. Вторая стадия - достижение неограниченного пролиферативного потенциала: некоторые клетки, преодолев состояние кризиса, могут возобновить пролиферацию и стать иммортализованны-ми. Иммортализация, вызванная вирусом папилломы человека, также осуществляется через эти две стадии (De Silva et al., 1994). Наличие кризиса, возможно, говорит о том, что для иммортализации клеток действия только вируса SV40 недостаточно. В пользу этого предположения свидетельствуют и данные, по иммортализации клеток человека химическими и физическими канцерогенами, когда требовалась многократная обработка клеток агентом для успешного выделения бессмертных линий (Dorman et al., 1983; Namba et al., 1988). Предполагается, что состояние кризиса, при котором не происходит общего роста популяции, это следствие действия доминантного супрессора, инактивации которого ведет к иммортализации (Shay, Wright, 1989; Sandhu, et al., 1994). Это событие может быть как спонтанным, так и индуцированным присутствующим в клетке вирусом. В большинстве случаев при получении иммортализованных линий клеток человека кризис наблюдается (Neufeld et al., 1987; Wright et al., 1989; Bartek et al., 1991), но имеются данные, показывающие возникновение перевиваемых линий человека и без кризиса (Miranda et al., 1983; Wynford-Thomas et al., 1990). Наши исследования показали, что полученные линии иммортализованных клеток, по-видимому, не претерпели кризиса. Однако факт получения большого количества фокусов трансформации на начальной стадии в этом эксперименте и дальнейшая постепенная гибель этих клеток, увеличивших продолжительность своей про-лиферативной жизни на 20-60 удвоений популяции сверх предела, отпущенного нормальным клеткам человека, подтверждают представление о том, что наличие кризиса является характерной чертой иммортализации клеток под действием SV40.
Иммортализация клеток, как правило, сопровождается возникновением ряда признаков злокачественной трансформации. Клетки полученных иммортализованных линий были подвергнуты анализу по некоторым из них, а именно: повышению эффективности посева на субстрате, увеличению скорости роста клеток, появлению признака независимого роста клеток от содержания сыворотки в культуральной среде и их способность расти в полужидком агаре.
Б. Характеристика диплоидных фибробластов и клеток иммортализованных линий. Морфология клеток обеих полученных иммортализованных линий (рис. 95 Б, В, Г) отличается от морфологии нормальных фибробластов (рис. 95 А) и характеризуется наличием округлых, гексагональных и
