Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
270
Рис. 95. Диплоидные фибробласты человека
А — эмбриональные диплоидные фибробласты, х160; Б — иммортализованные клетки, полученные при трансфекции плазмидой pSV3neo, содержащей последовательность, кодирующую Т-антиген, х400, фазовый контраст.
271
:<УЖ
Г
яШвк: :Л-'^1
Рис. 95 (В, Г)
В - иммортализованные клетки, полученные под действием ta-мутанта SV40, культивировавшиеся при лер-миссивной (33 °С) для вируса температуре. х160: Г - иммортализованные клетки, полученные под действием -мутанта SV40, культивировавшиеся при непермиссивной (39 °С) для вируса температуре, х400
272
Время культивирования, дни
Время культивирования, дни
Рис. 96. Зависимость скорости роста клеток от содержания сыворотки в среде. Скорость роста диплоидных (1, 2) и иммортализоваиных (3-6) клеток при 5% (А) и 10% (Б) эмбриональной сыворотки в среде
Линии 3, 4, 5 соответствуют иммортализованным клеткам, полученным под действием ts-мутанта SV40, культивировавшимся при разных температурах; линия 6 - иммортализованным клеткам, полученным при трансфекции плазмидой pSV3neo. Для линий 1, 3 температура культивирования 39 °С, для линий 2, 5, 6-37 °С; для пинии 4 - 33 °С
треугольных клеток с пониженной адгезивностью, рост которых малоупорядочен. При переносе иммортализоваиных клеток, полученных под действием rs-мутанта SV40, в непермиссивную для вируса температуру не наблюдалось реверсии к норме морфологии клеток (рис. 95, В, Г). Иммортализован-ные клетки изменили скорость роста, успешно размножаясь при пересеве в соотношении 1:4, 1:6, в то время как диплоидные фибробласты лишь в соотношении 1:2.
Клетки полученных иммортализоваиных линий были испытаны нами на наличие признаков злокачественной трансформации (см. табл. 2). Помимо способности культивироваться неопределенно долго in vitro, эти клетки могут быть клонированы при низкой клеточной плотности, обладают снижением зависимости скорости роста от количества сыворотки в культуральной среде, но не растут в полужидком агаре и не способны образовывать опухоли при инокуляции лабораторным животным. Известно, что злокачественная трансформация - многоэтапный процесс, следовательно, появление признаков трансформированного фенотипа может происходить независимо и разновременно. Рост в агаре характерен для клеток, находящихся на более поздней стадии малигнизации, и больше других признаков коррелирует с прививаемостью (Bols et al., 1991). Нормальные фибробласты человека очень требовательны к составу ростовой среды, в особенности к такому фактору, как сыворотка. Клетки иммортализоваиных линий при пониженном (5%) содержании сыворотки в среде сохраняли скорость роста, характерную для исходных диплоидных фибробластов, растущих в среде с 15% сыворотки (рис. 96).
Для выяснения роли вирусного онкобелка (Т-антигена) в иммортализа-ции клеток, во-первых, определяли наличие генома вируса в полученных линиях методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Rinehart et al., 1993) и,
273
во-вторых, экспрессию Т-антигена при помощи стандартной реакции непрямой иммунофлуоресценции (Marschak et al., 1975). Результаты ПЦР-анализа при исследовании клеток, трансформированных fo-мутантом SV40, свидетельствуют о присутствии последовательностей ДНК вируса на ранних пассажах и об их отсутствии на более поздних пассажах. Иммортализованные клетки, полученные при трансфекции плазмидой, содержащей последовательность, кодирующую Т-антиген, показали присутствие его последовательностей в геноме клеток на всех исследованных пассажах. Аналогичные результаты получены при изучении иммортализованных клеток на наличие экспрессии онкобелка. Причем для клеток, полученных в случае инфекции WSV40, это верно как для пермиссивной так и непермиссивной температур.
Одной из важных характеристик иммортализованных пиний является кариотип клеток. Нормальные фибробласты человека имеют диплоидный кариотип (2п = 46). Для всех трансформированных клеток характерно увеличение частоты аномалий числа хромосом, т.е. анеуплоидия, а также количество хромосомных аберраций. Показано (Counter et al., 1992), что до кризиса значительно увеличивается количество хромосомных аберраций, но после неrq их число стабилизируется и даже уменьшается. Кариотип иммортализованных клеток обеих линий характеризуется ярко выраженной анеуп-лоидией. Следует отметить, что модальный класс, представленный клетками с 46 хромосомами, составлял 26% для непермиссивной температуры и 40% для пермиссивной, а также при этой температуре не наблюдаются хромосомные перестройки. Для клеток, трансфицированных плазмидой, содержащей последовательность ДНК вируса SV40, модальный класс выделить трудно, околодиплоидное число хромосом встречается в 5% изученных метафаз, о к о л от р и п л о и д н о е - в 60%, причем в основном эти клетки имеют перестроенный кариотип (дицентрики, хромосомные фрагменты, хроматид-ные разрывы, дупликации). В 30% исследуемых клеток содержатся полицен-трические хромосомы, образующиеся в результате слипания теломерных участков хромосом. Расстояние между центромерами в наблюдаемых ассоциациях хромосом значительно больше, чем суммы длин плеч хромосом, участвующих в ассоциации. На основании этих наблюдений можно предположить, что в теломерах происходит амплификация генетического материала. Таким образом, анализ полученных данных позволяет говорить вероятнее всего о разных механизмах иммортализации клеток человека. Данные, относящиеся к анализу иммортализованной линии, полученной с помощью инфекции клеток toSV40, говорят в пользу того, что вирус SV40 имеет непосредственное отношение к возникновению иммортализованного фенотипа на первых этапах, когда, по-видимому, реализуется его мутагенный эффект. Т.е. возможно, SV40 определяет иммортализацию за счет индукции активирующих мутаций в клеточных протоонкогенах или инактивации генов-супрессоров (Варшавер, 1996), действуя по типу “hit and run” (Galloway, McDougall, 1983; Bouchard et al., 1988). Весь приведенный материал, касающийся иммортализованной линии, выделенной после трансфекции плазмидой, не позволяет определенно говорить о механизме возникновения иммортализованного фенотипа в этих клетках. Возможно, в этом случае для иммортализации необходимо присутствие вирусного онкобелка. Для решения этого вопроса необходимо проведение более длительного исследования этих клеток.
