Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
В работах Хейфлика (Hayflick, Moorhead, 1961; Hayflick, 1965) сформулированы некоторые свойства, присущие нормальным диплоидным клеткам: клетки, выделенные из эмбрионов человека, совершают ~50 удвоений популяции;
у диплоидных клеток человека число удвоений популяций обратно пропорционально возрасту донора;
штаммы клеток, выделенных из нормальных тканей, имеют диплоидный кариотип;
нормальные штаммы клеток, в отличие от иммортализованных линий, не способны к репликации в суспензионной культуре. Это свойство получило название зависимости от прикрепления к субстрату (anchorage dependence);
штаммы диплоидных клеток человека не вызывают опухолей при их инокуляции лабораторным животным;
штаммы диплоидных клеток человека можно хранить замороженными, причем клетки “помнят” на каком уровне удвоения их заложили на хранение, даже при длительном времени хранения.
Эти характеристики позволили исследователям (Хейфлик, 1997) разделить все культуры клеток человека и животных на три категории (табл. 1).
Нормальные клетки человеческого организма редко претерпевают (или никогда не претерпевают) спонтанную иммортализацию in vitro в отличие от клеток грызунов. Биологический смысл этого сЬакта, по-видимому, заключается в том, что у человека, как у более долго живущего, чем грызуны, организма значительно сильнее действуют механизмы, препятствующие клеточной трансформации. Поэтому получение иммортализованных клеток человека в отличие от клеток грызунов представляет определенные трудности (Curatolo et al., 1984; Kraemer et al., 1986; McCormick, Maher, 1988) и мировая коллекция иммортализованных диплоидных клеток человека значительно беднее, чем клеток грызунов. Речь здесь не идет о клеточных линиях, происходящих из опухолевых клеток Иммортализация фибробластов человека под влиянием различных агентов происходит с более низкой час-тототой (1CF7), что сопоставимо со спонтанными мутациями генов в клетке (Sager, 1984; Fry et al., 1988; McCormick, Maher, 1988).
261
Природа злокачественого перерождения клетки (малигнизация) составляет предмет изучения клеточной и молекулярной биологии постольку, поскольку на этом уровне исследования находится ответ на вопрос о причинах сбоя регуляции развития, в результате которого клетка получает импульс к неконтролируемому делению. Иммортализованные диплоидные клетки человека могут служить моделью, в частности, для идентификации генов, ответственных за иммортализацию, т.е. за первый этап процесса малигни-зации.
Наиболее часто в качестве индуктора иммортализации клеток человека используют вирус SV40 (обезъяний вирус 40), а также его мутанты и конструкции, несущие различные последовательности вируса (Neufeld et al., 1987; Shay, Wrigh, 1989; Bartek et al., 1991; Rinehart et al., 1993). Особый интерес представляют условно иммортализованные линии клеток человека, получаемые под действием температурочувствительных (ts) мутантов SV40, несущих мутации в ранней области (ген А), кодирующей трансформирующий белок Т - антиген (Wynford-Thomas et al., 1990).
Задача наших исследований состояла в получении под действием tsA -мутанта вируса SV40 и плазмиды pSV3/2eo, имеющей в своем составе ген А, иммортализованных клеток человека и последующей их характеристики с целью выяснения роли вируса в поддержании иммортализованного фенотипа (см. раздел “Основная часть”).
ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ
КЛЕТОЧНЫХ МОДЕЛЕЙ НЕКОТОРЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА
НА ПРИМЕРЕ ГЕНА ПРЕСЕНИЛИНА-1
Болезнь Альцгеймера (БА) - наиболее часто встречающееся нейродеге-неративное заболевание людей в среднем и пожилом возрасте. Ранняя семейная форма, составляющая около 10% всех случаев БА, характеризуется началом заболевания в возрасте до 65 лет, быстрым прогрессированием и связана с аутосомно-доминантным наследованием мутаций в трех генах: предшественнике (3-амилоида (арр), пресенилине-1 (hpsl; Sherrington et al.,
1995) и пресенилине-2 (hps2\ Rogaev et al., 1995) (структура гена пресенилина-1 представлена на рис. 92).
Следует отметить, что за развитие ранней семейной формы БА более чем в 60% случаев, отвечают мутации в гене hpsl. Основным гистопатоло-гическим признаком БА является накопление сенильных бляшек и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков, которое сопровождается массовой гибелью нейронов в ряде структур головного мозга. Каким образом мутации, в частности в генах hpsl и hps2, влияют на развитие перечисленных признаков, до конца не известно. По ряду выдвигаемых гипотез оно сводится к следующему:
изменению процессинга, а также стабильности комплексов ряда белков (самих пресенилинов, предшественника (3-амилоида, некоторых белков систем передачи информации в клетке и др.);
изменению транскрипционной активности ряда генов;
нарушению клеточного гомеостаза: дестабилизации кальциевого обмена, оксидативному стрессу, дисфункции митохондрий и др.
262
На сегодняшний день наиболее популярной моделью изучения патогенеза Б A in vitro яв таются клеточные линии, трансфицированные различными (нормальными и мутантными) формами генов Б А. Так, в ряде работ (Yamatsuji et al., 1996; Nishimura et al., 1998) экспрессия гена, кодирующего APP, как с мутациями, приводящими к развитию Б А, так и без них, вызывала апоптоз в трансфицированных клеточных линиях. Повышенная чувствительность к различным апоптотическим стимулам (депривации по трофическим факторам, оксидативному стрессу, действию (3-амилоида) показана в культурах с гиперэкспрессией ряда мутантных форм генов hpsl и hps2 (Guo et al., 1996, 1997, 1998; Deng et al., 1996; Wolozin et al., 1996, Чернявская и др., 1998). Следует отметить, что получение клеточных систем с негативным воздействием мутантных форм гена hpsl представляется актуальным в свете использования их как модельных при поиске и тестировании лекарственных препаратов (потенциальных агентов для терапии БА), способных увеличивать жизнеспособность клеток.
