Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Свердлов Е.Д. -> "Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1" -> 144

Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.

Свердлов Е.Д. Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 — М.: Наука, 2003. — 372 c.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка): perspektivimoleculyargenetiki2003.djvu
Предыдущая << 1 .. 138 139 140 141 142 143 < 144 > 145 146 147 148 149 150 .. 199 >> Следующая

4. Механизм действия онкогена не является инсерционным и, по-видимому, принадлежит к типу “hit-and-run”.
266
Несмотря на то, что величина индукции под влиянием онкогена, учитываемая по одному гену, является относительно низкой, суммарное увеличение уровня индуцированного мутагенеза на геном клетки может быть значительным. В таком случае мутация в каком-либо протоонкогене, превращающая его в онкоген, будет повышать частоту мутаций на геном и тем самым способствовать увеличению генетической нестабильности трансформированных клеток.
ИММОРТАЛИЗАЦИЯ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА
А. Получение иммортализованных фибробластов. В экспериментах по получению иммортализованных линий, наряду с фибробластами, использовались и другие типы клеток человека: эпителиальные эмбриональные клетки кишечника, миобласты скелетных мышц, клетки щитовидной железы, кератиноциты, клетки эндометрия, клетки глии. Также широк спектр индуцирующих иммортализацию агентов - от онковирусов, химических канцерогенов до гамма-облучения. Данные по получению некоторых иммортализованных линий клеток и их характеристики приведены в табл. 2.
Общепринятая схема получения иммортализованных линий клеток человека включает три основных этапа:
Культивирование первичных диплоидных клеток человека на специальных средах, обеспечивающих оптимальные условия роста;
Обработка клеток индуцирующим иммортализацию агентом;
Отбор полученных клонов-трансфектантов, с их последующей характеристикой.
Наши работы мы проводили в сотрудничестве с коллегами из Медикогенетического научного центра (МГНЦ) В.Г. Черниковым и Г.Б. Раевской, откуда были получены первичные диплоидные фибробласты человека. Подробные схемы экспериментов по получению иммортализованных линий клеток под действием tsA мутанта SV40 и плазмиды pSV3neo описаны в статьях (Иноземцева и др., 1997; 2001). Здесь же следует отметить некоторые важные моменты этих работ.
Для получения линий иммортализованных фибробластов человека были выбраны два варианта воздействия онкогенного вируса SV40 на нормальные клетки: tsA мутантом вируса и вектором pSV3neo, содержащим последовательность ДНК, кодирующую ранние белки вируса SV40, в том числе большой Т-антиген, а также бактериальный ген пео в качестве селективного маркера.
Чем был обусловлен наш выбор вируса SV40, как индуктора иммортали-зации? Во-первых тем, что он был всесторонне изучен и генетически и вирусологически. Во-вторых, к началу наших опытов (конец 80-х - начало 90-х годов) среди многочисленных работ нашей Лаборатории по изучению мутагенеза, индуцированного различными мутагенами, проводились работы, посвященные изучению генетического контроля процессов репарации и мутагенеза, индуцированного онкогенными вирусами, в частности, вирусом SV40 (Marshak et al., 1975; Varshaver et al., 1980; Gorbunova et al., 1982; Shapiro et al., 1984; Rayevskaya et al., 1989). Хорошо известно, что каждый вид вирусов имеет свой круг хозяев, в клетках которых они могут размножаться.
267
Таблица 2. Характеристики некоторых иммортализованных линий клеток млекопитающих
Клетки Трансфор- мирующий агент Время жизни Ускорение роста Эффек-i ..внисть посева, %
1 2 3 4 5
Эмбриональные эпителиальные клетки кишечника SV40 33 пассажа Ни 4,5
Миобласты скелетных мышц SV40 4—8 мес. + Ни
Клетки щитовидной железы tsSV40 >200 УП + 9,8
Кератиноциты AD12-SV40 >1года Ни Ни
Клетки эндометрия MNNG >2 лет + 10,0
Клетки глии SV40 ori 80 УП Ни Ни
Фибробласты у-лучи Неогр. + 16.0
Фибробласты 4NQO MNNG 2 года Ни Ни
Фибробласты, пигментная ксе-родерма SV40 ori 2 года + 40,0
Астроциты спинного мозга эмбриона человека Adl6 18 мес. + Ни
Фибробласты взрослого человека pSV3neo >60 пассажей + 4,3
Фибробласты эмбриона чело- tsSV40 >2 лет века % Модальное число хромосом в двух линиях из трех = 46. + 28,1
Примечание. Ни - не исследовалось, УП - удвоение популяции: плюс - да, минус - нет.
Те виды инфицированных вирусом клеток животных, где он размножается, так называемые пермиссивные, в конечном счете гибнут. В клетках, принадлежащих другим видам млекопитающих, где вирус размножаться не способен, его геном встраивается в геном клетки хозяина и, как правило, трансформирует ее. Клетки человека - непермиссивная для вируса SV40 система. Как уже говорилось, было показано, что ген А (онкоген SV40), определяет не только возможность встройки генома вируса в геном клетки хозяина, но и обусловливает трансформацию нормальной клетки в злокачественную. Температурочувствительный мутант этого гена может обусловить трансформацию только в условиях пермиссивной температуры (33 °С) и не способен осуществить ее при непермиссивной (40 °С). В этом случае мы имеем дело как бы не с изменением вируса в целом, а с изменением только его онкогена. Поэтому, проводя эксперименты в непермиссивных для вируса условиях, можно выяснить роль онкогена в возникновении и становлении иммор-тализованного фенотипа клеток. Схема эксперимента с использованием плазмиды pSV3neo современнее, но требует предварительной отработки условий трансфекции вектора в клетки методом электропарации. Входящий в состав плазмиды ген пео облегчает отбор трансфектантов на селективной
Предыдущая << 1 .. 138 139 140 141 142 143 < 144 > 145 146 147 148 149 150 .. 199 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed