Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
кислоты, вводя в реакционную ячейку смесь фермента с ингибитором.
Действительно, наблюдаемые закономерности формально эквивалентны случаю
неконкурентного ингибирования. Однако смысл этой зависимости для системы
индометацин - PGH-синтетаза совершенно отличен от смысла механизма
классического неконкурентного ингибирования. В обсуждаемой системе
ингибитор блокирует часть активных центров фермента, при этом,
естественно, характеристики свободной формы фермента, такие, как
наблюдаемая константа Михаэлиса, остаются без изменения.
Бруфен, напроксен, бутадион, анальгин -
быстрые, обратимые ингибиторы
PGH-синтетазы
Исследование ряда других нестероидных противовоспалительных препаратов
показало, что они являются быстродействующими и обратимыми ингибиторами
исследуемого фермента. При добавлении их к раствору фермента можно
наблюдать быстрое подавление активности катализатора, которое постоянно
во времени (см., например, рис. 6). Изучение этого класса ингибиторов
было проведено в рамках известных подходов к исследованию влияния их на
скорость ферментативной реакции в присутствии субстратов [26].
Были исследованы зависимости скорости реакции от концентрации
субстратов при различных концентрациях ингибиторов. Как известно, в
реакции, катализируемой PGH-синтетазой, принимают участие следующие
субстраты: арахидоновая кислота,
кислород и восстановитель - донор электронов '[27]. Зависимости скорости
реакции от концентрации арахидоновой кислоты и адреналина при различных
концентрациях бруфена приведены на рис. 7. Эти же зависимости для
напроксена аналогичны. Бутадион и анальгин также являются обратимыми
ингибиторами PGH-синтетазы, однако эффективность ингибирования бутадионом
и анальгином несколько ниже, чем бруфеном и напроксеном.
С формально кинетической точки зрения указанные ингибиторы (бруфен,
напроксен, бутадион, анальгин) выступают в качестве конкурентных
ингибиторов по отношению к арахидоновой кислоте и в качестве
бесконкурентных ингибиторов по отношению
11
к донору электронов. Эти эффекты ингибирования для случая
многосубстратной реакции потребовали специального рассмотрения.
Рис. 7. Зависимость скорости PGH-синтетазной реакции
(микросомная фракции везикулярных желез) от концентрации арахидоновой
кислоты (о) и адреналина (б) в обратных координатах при различных
концентрациях бруфена (мкМ). На с / - 0; 2 - 8; 3 - 15; 4-25; 5 - 35; 6 -
50; на б: 1 - 0; 2 - 25; 3 - 50; 4 -126. Услория: 32°С, pH 7,2, 20 мМ
фосфат, 1,6% этанола, 0,1% твин-20, ге-мин 1,8 мкМ, 1,1 мМ адреналина
(а); 73,5 мкМ арахидоновой кислоты (б)
Обратимое ингибирование многосубстратных ферментативных
реакций
Изучение механизмов обратимого ингибирования ферментативных реакций -
предмет детального анализа в энзимологической литературе [28]. Однако
анализ-закономерностей ингибирования ферментов был посвящен в основном
односубстратным реакциям. Очевидно, что многосубстратная природа реакций
должна весьма специфическим образом отражаться в кинетике ингибирования,
и для многосубстратных реакций должны существовать особые закономерности
ингибирования. Рассмотрим эти закономерности для случая упорядоченных
механизмов реакций.
Как показано ранее, механизмы двухсубстратных ферментативных реакций
можно разбить на два принципиально различающихся класса по зависимости
скорости реакции от концентрации обоих субстратов. Первую категорию
реакций составляют процессы, уравнения скорости для которых не содержат
произведения концентраций двух субстратов. Эта категория реакций,
механизмы которых получили название механизмов с немультиплицирующи-ми
субстратами. Было показано, что необходимым условием для реализации
данного типа механизма является наличие по крайней (мере одной
необратимой стадии между двумя пунктами ввода суб-
стратов в механизм превращения. Простейшую каноническую схему такой
реакции можно представить в виде
Для простоты примем, что стадии ввода субстратов являются обратимыми и
быстрыми и могут быть охарактеризованы константами равновесия (комплексы
субстратов с активными центрами ферментов).
Второй класс реакций образуют процессы, уравнения 'скорости для
которых включают произведение концентраций субстратов. Это реакции с так
называемыми мультиплицирующими субстратами. Необходимым условием
реализации мультиплицирующего механизма является обратимость всех стадий
между двумя точками ввода двух различных субстратов. Простейшая
каноническая схема для механизма с мультиплицирующими субстратами может
быть записана в виде
Si Sa k
X1^Xt7^Xa-.Xl. (9)
я. к.
Предполагается, что стадии ввода субстратов являются обратимыми, быстрыми
и могут быть охарактеризованы константами равновесия Ki и Кг-
Рассмотрим зависимости скорости от концентраций обоих субстратов и
концентрации обратимого ингибитора для механизмов обоих классов.
