Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
А/Ао рис 2. Кинетика изменения ак-
Лспирин - медленный необратимый ингибитор эндопероксидпро-
стагландинсинтетазы
1,0
тивности PGH-синтетазы при инкубации фермента (микросомы везикулярных
желез барана) в растворах аспирина разной кон-
0,6
центрации (мМ).
0,2
/ - 0,81; 2 - 2,35; 5 - 4,36. Условия: 32°С, pH 7,2, 20 мМ фосфата, 1,7%
этанола, 0,1% твин-20. А0 - активность фермента в отсутствие ингибитора,
А -активность'фермента в момент времени
20
60 мин
t при инкубации с ингибиторои
б
t
Процесс инактивации фермента необратим. Существенное уменьшение
концентрации ингибитора в среде путем разбавления раствора фермента с
аспирином не приводит к появлению его активности. Инактивацию фермента
нельзя объяснить его денатурацией, поскольку в контрольном опыте в
отсутствие аспирина фермент практически полностью сохраняет свою
активность.
Простейший кинетический механизм, описывающий наблюдаемые
экспериментальные зависимости, имеет вид
e + iXei, (1)
где Е - свободная форма фермента; 1 - ингибитор; EI - соединение
ингибитора с активным центром фермента.
В условиях избытка ингибитора по сравнению с концентрацией активных
центров фермента (в случаях с нестероидными противовоспалительными
соединениями это соотношение всегда имеет место) кинетику изменения
концентрации активного фермента во времени будет описывать уравнение
с
Е = ?0е-*Ч (2)
где Е0 - начальная концентрация активных центров;' 10 - начальная и
постоянная концентрация ингибитора (10^>Е0). Поскольку измеряемая на
опыте активность PGH-синтетазы линейно зависит от концентрации фермента,
по тому же закону должна меняться и активность катализатора.
Зависимость (2) при ингибировании аспирином действительно имеет место,
что иллюстрирует рис. 3. Кинетические кривые описываются уравнением
первого порядка, при этом показатель экспоненты линейно зависит от
концентрации ингибитора (рис. 36). Тангенс угла наклона этой зависимости
позволяет определить константу скорости необратимого взаимодействия
аспирина с активным центром фермента. Видно, что необратимая инактивация
PGH-синтетазы аспирином сравнительно медленный процесс.
Соответствие кинетики инактивации фермента уравнению первого порядка в
условиях избытка ингибитора указывает на то, что реакция между активным
центром фермента и аспирином действительно протекает в стехиометрическом
соотношении 1:1. Эти количественные результаты, полученные кинетическими
методами, полностью согласуются с известными литературными данными [14,
22, 23].
Индометацин и вольтарен - медленные, эффективные, обратимые
ингибиторы *
PGH-синтетазы
Инкубация PGH-синтетазы с индометацином так же, как и в случае с
аспирином, приводит.к потере ферментом его активности, и этот процесс
также развивается во времени (рис. 4). Принципиальное отличие в
механизмах действия этих лекарственных пре-
7
паратов заключается в том, что индометацин представляет собой обратимый
ингибитор PGH-синтетазы. '
Этот вывод основывается на двух сериях экспериментов.
1. Обратимость взаимодействия индометацина с PGH-синте-тазой
следует из того факта, что после отделения ингибитора от фермента
активность PGH-синтетазы восстанавливается. Так, PGH-синтетазу
микросомной фракции тромбоцитов человека обрабатывали индометацином в
концентрации 7,5-10-6 М в течение
мин
Рис. 3. Ингибирование PGH-сш-тетазы аспирином. а - линеаризация данных
рис. 2 в полулогарифмических координатах; концентрации аспирина
(мМ): 1 - 0,81; 2 - 2,35; 3 -
4,36; б - зависимость наблюдаемой константы
скорости инактивации первого порядка от концентрации аспирина
Рис. 4. Ингибирование PGH-сии-тетазы индометацином. а - кинетические
кривые изменения активности Рб/Лсинтетазы из везикулярных желез барана
при инкубации фермента в растворах индометацина разной концентрации
(мкМ); 1 - 1,4; 2 - 2,2; 3 - 3,8; 4 - 5,4. Условия: 32°С, pH 7,2, 20 мМ
фосфата, 1,7% этанола, 0,1% твин-20; б - зависимость относительной
предельной активности фермента от концентрации индометацина
40 мин. Остаточная активность в результате такой обработки составляла
28%- Однако после отделения микросом от раствора центрифугированием (105
000 g, 1,5 ч) и промывки их буферным раствором активность фермента
восстанавливалась практически полностью (составляла 95% от исходной).
PGH-синтетазу из везикулярных желез иммобилизовали на DEAE-сефадексе.
В результате обработки иммобилизованного фермента раствором 2,6-10-5 М
индометацина в течение часа актив-ность фермента падала до 23%; после
отфильтровывания и промывки иммболизованного фермента буферным раствором
его активность увеличивалась и составляла 70% от исходной.
8
Из этих данных следует, что взаимодействие PGH-синтетазы с
