Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
индометацином имеет обратимый характер.
2. Кинетические измерения показали, что схема взаимодействия PGH-
синтетазы с индометацином имеет вид
Кинетические кривые изменения активности PGH-синтетазы в процессе
инкубации фермента с индометацином приведены на рис. 4. Видно, что даже
при длительном времени инкубации активность фермента не падает до нуля, а
достигает некоторого предельного значения, зависящего От концентрации
ингибитора.
Рассмотрим особенности кинетики процесса для обоих этих случаев. Для
необратимой инактивации в условиях соизмеримости /0 и Ео справедливо
соотношение
при бесконечном времени) и t-*-oo имеют место условия:. ?о///о?->-0 или
/-*-0. Для них концентрация соединения EI цри бесконечном времени равна
/о. Из уравнения материального баланса следует
где Еоа - остаточная предельная концентрация фермента. Иле-соотношения
(5) при пропорциональности активности концентрации фермента следует, что
для случая необратимой инактивации в условиях 1о~Ео относительная
активность фермента должна линейно падать с ростом концентрации
ингибитора.
Зависимость предельной относительной активности от концентрации
ингибитора приведена иа рис. 46. Видно, что уравнение (5) (пунктирная
линия) не описывает существующей зависимости.
Кинетические данные согласуются со схемой (3), согласно которой
индометацин представляет собой медленный обратимый ингибитор PGH-
синтетазы. В соответствии с этой схемой изменение концентрации комплекса
фермент-ингибитор во времени должно быть представлено уравнением
Соответствие экспериментальных данных уравнению (7) иллюстрирует рис. 5.
Зависимость обратного наблюдаемого характерно-
к.
Е+1^1
EI.
(3)
к
ЕМо-Е1) _ /0(Е0-Е/)
(4)
При Ео>1о (условие сохранения остаточной активности фермента
(5)
(6)
а относительное изменение активности уравнением А> " Vo+*-x 1
Ь
(7)
9
тического времени представлена линейной функцией концентрации ингибитора,
из которой следуют константы скорости прямой и обратной реакции и
соответственно константа равновесия образования комплекса.
Совершенно аналогично индометацину ведет себя в реакции ингибирования
PGH-синтетазы вольтарен. Кинетические кривые падения активности фермента
при различных концентрациях воль-тарена подобны приведенным на рис. 4а.
Они так же спрямляются в рамках-координат уравнения (7), давая
зависимость обратного характеристического времени от концентрации
ингибитора, из которой могут быть найдены константы скорости прямой и
обратной реакций взаимодействия вольтарена с активным центром фермента.
Индометацин и вольтарен относительно медленно взаимодействуют с
активным центром PGH-синтетазы. Процесс установления равновесия занимает
более 10 мин. Если в реакционную смесь для измерения активности фермента
вводить равновесную реакционную смесь фермент - ингибитор, по
детектируемой активности можно "оттитровать" находящийся в растворе
свободный фермент.
Рис. 5. Кинетические характеристики ингибирования PGH-синтетазы
индометацином. а - линеаризация данных рис. 4 а по ингибированию PGH-
синтетазы индометацином ¦ в координатах уравнения (7); концентрации
ингибитора (мкМ): 1 - 1,4; 2 - 2,2; 3 - 3,8; 4 - 5,4; б - зависимость
наблюдаемой константы скорости инактивации первого порядка от
.концентрации индометацина; - активность фермента при длительном
(бесконечно большом) времени инкубации с ингибитором
мин
Рис. 6. Изменение во времени активности PGH-синтетазы при инкубации
фермента (микросомная фракция везикулярных желез) с бутадионом (мМ).
7 - 0,62; 2 - 3,4; 3 - 4,2. Условия: 32°С,
pH 7,2, 20 мМ фосфат, 1,6% этанола, 0,1% твин-20
10
При этом из зависимости скорости реакции от концентрации субстрата при
различных концентрациях ингибитора можно было бы наблюдать кажущийся
эффект неконкурентного ингибирования (влияние концентрации ингибитора на
максимальную скорость при постоянном значении наблюдаемой константы
Михаэлиса). В реакции ингибирования PGH-синтетазы индометацином такой
кажущийся эффект неконкурентного ингибирования действительно имеет место.
В раствор PGH-синтетазы вводили индометацин в различных концентрациях,
смесь фермента с ингибитором инкубировали около часа для установления
равновесия, "замораживали" равновесие понижением температуры до 4°С,
после чего изучали зависимости скорости от концентрации арахидоновой
