Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
а), а другой - при условии DTT I/DTTSh = Ю3, когда NI стабильнее D
s s
на 6,2 ккал/моль (рис. III, 9, б). Последняя величина близка энергии стабилизации нативной конформации БПТИ, утрачиваемой в растворе с 8 М концентрацией мочевины.
Энергетический профиль ренатурации БПТИ (рис. Ш, 9, б) свидетельствует, во-первых, о кооперативности процесса, поскольку все промежуточные состояния с одной или двумя дисульфидными связями тер-
S
модинамически нестабильны относительно D и NI, и, во-вторых, о
сравнительно свободном кинетическом пути свертывания белковой цепи
S
и, следовательно, большой вероятности нахождения состояния NI в
S
глобальном минимуме. Из последнего можно заключить о согласованности между термодинамикой и кинетикой процесса ренатурации.
Установлением пути свертывания полипептидной цепи БПТИ еще не заканчивается изучение механизма обратимой денатурации белка. Исследования Крейтона во многом помогли ответить на вопрос о том, как осуществляется процесс спонтанной структурной самоорганизации белка в условиях in vitro. Так детально и аргументировано это было сделано впервые. Следующая задача заключается в том, чтобы понять полученные данные, т.е. ответить на вопрос, почему процесс сборки нативной конформации белка осуществляется именно таким, а не иным образом, в чем заключается физика явления обратимой денатурации, каково взаимоотношение процессов in vitro и in vivo. Т. Крейтон уделяет внимание этому вопросу, однако его анализ имеет чисто описательный, феноменологический характер и качественно отличается от экспериментальной части его исследования.
12.4. РЕНАТУРАЦИИ РИБОНУКЛЕАЗЫ
Наиболее интересно сопоставление результатов денатурации БПТИ, выбранного в качестве тест-объекта, с данными денатурации бычьей панкреатической рибонуклеазы - классического объекта, изученного также детально. В отличие от БПТИ, здесь нет столь же полной информации о промежуточных продуктах и последовательности конформационных переходов от состояния D к N. Выше отмечалось,
373
что Анфинсеном была впервые показана спонтанность процесса ренатурации рибонуклеазы, завершающегося образованием четырех дисульфидных связей нативной конформации белка и полным восстановлением ферментативной активности. Позднее это было подтверждено рядом исследований.
При изучении свертывания рибонуклеазы большой интерес вызвал факт более быстрой реставрации дисульфидных связей по сравнению с восстановлением ферментативной активности белка. Он был обнаружен Анфинсеном и соавт. [79] в 1961 г. при окислении денатурированной рибонуклеазы кислородом воздуха и объяснен образованием неправильных S-S-связей, которые со временем перераспределяются в правильные, что и лимитирует скорость укладки нативной конформации. Этому объяснению, однако, противоречило более позднее наблюдение того же Анфинсена за скоростью восстановления активности белка, которая оказалась обратно пропорциональной его концентрации [80]. Тогда было предположено образование денатурированными цепями рибонуклеазы межмолекулярных дисульфидных связей, которые со временем разрываются и переходят в правильные внутримолекулярные связи. Очевидно, что чем больше концентрация денатурированного белка, тем вероятнее ассоциация их молекул посредством S-S-связей и медленнее восстановление активности. Процесс окисления восстановленной рибонуклеазы кислородом воздуха оказался, таким образом, отягощенным побочными явлениями, не имеющими прямого отношения к механизму молекулярной реоксидации.
Г. Шерага и соавт. [81], Д. Уетлауфер и соавт. [82] отказались от реокисления рибонуклеазы кислородом воздуха и использовали для образования S-S-связей реакцию тиол-дисульфидного обмена с помощью глутатиона. В обеих работах отмечено быстрое появление промежуточных продуктов с тремя S-S-связями, после которого наступали продолжительный период переориентации взаимодействующих остатков Cys и рост ферментативной активации. Авторами была принята точка зрения Анфинсена и соавт. [79] относительно образования на первом этапе реоксидации ' большого числа промежуточных продуктов с неправильными дисульфидными связями.
Исследования Р. Болдвина и соавт. [56] и Т. Крейтона [83, 84] показали, что повторное свертывание рибонуклеазы с четырьмя правильными дисульфидными связями может происходить in vitro быстро, если придерживаться условий, близких к условиям укладки белковой цепи БПТИ. Для интерпретации промежуточных состояний и определения скорости образования S-S-связей ход процесса ренатурации рибонуклеазы, как и в случае БПТИ, блокировался на разных стадиях, выделялись промежуточные продукты и с помощью электрофоретической подвижности они анализировались. На начальном этапе сборки полипептидной цепи наблюдалась близкая аналогия в
s
