Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
SH
скорости восстановления дисульфидов дитиотреитолом в форме DTTsH: DTTch + RSSR............> DTT|hR быстр° ) DTT I + RSH.
RSH
Скорость реакции здесь лимитируется первой стадией. Реакция будет необратима, если не добавлять в раствор RSH. Сульфгидриль-SH
ные группы DTTSH имеют различные значения рК (8,3 и 9,5), поэтому при промежуточном значении pH раствора в ионной форме может находиться только одна группа. Значение константы реакции зависит от химической природы заместителей в дисульфиде RSSR; его реакционная способность тем выше, чем электроположительнее R, что естественно, поскольку тиольная группа активна в своей анионной форме. Природа заместителя R отражается аналогичным образом и в
361
способности к ионизации меркаптановой группы RSH. Чем больше
парциальный положительный заряд R, тем меньше pKRSH и больше
скорость обмена кобм.
Т. Крейтон установил линейную зависимость между логарифмом
константы скорости второго порядка (1пК) и значением pKrsh> наклон
которой, а следовательно, и активность S-S-связи и тиольной группы
зависят от окружения [69]. Как и следовало ожидать, при
использовании в качестве денатуранта сильного электролита -
гуанидингидрохлорида (6 М раствор) - связь между 1пК и pKRSH
ослабляется (прямая близка к параллельной оси абсцисс), а
неэлектролита - мочевины (8 М раствор) - влияние почти не
обнаруживается (прямая находится под углом 45° к оси абсцисс).
Теперь на основе высказанных общих соображений рассмотрим
конкретный пример разрушения и образования S-S-мостика между
остатками Cys-14 и Cys-38 в нативной конформации БПТИ,
воспользовавшись для иллюстрации количественными данными
Крейтона [59]. Константа скорости реакции восстановления второго
S 5^1
порядка нативного белка (NI) с помощью DTTjh
S сн k+1 SSDTTSH k+2 s
Nj. + dttsh == Nsh =<н + D™
s k-i к_2 ь
оказалась равной 38 с-1 • моль-1, а кажущееся значение рК тиоль-S н
ных групп в NjH - 8,8. Зная pKRjH и ее зависимость от 1пК, находим константу скорости к+1, значение которой (28 с-1 ¦ моль-1) оказывается практически совпадающим с константами скоростей модельных соединений. Скорость образования дисульфидной связи
s
Cys-14—Cys-38 с использованием DTTI пропорциональна концентрации
реагента; при этом константа скорости реакции второго порядка равна 9,5 с-1 ¦ моль-1.
kx 1 _ kii
сн S _ _ SSDTTSH +z S SH
NSH + DTT^--------- NSH =N1 +DTTSH
k-1 1l.2
При константе равновесия К] = • моль-1 - скорость внутри-
молекулярного перехода, к+2 должна быть приблизительно 105 с-1, а соответствующий период полураспада т1/2~10-6 с (значением к+2 определяется из условия v+1 = v_, + v+2, а к_, - из формулы К, = k+]/k_i; малым значением к_2 пренебрегают). Относительная стабильность
S S
дисульфидных связей в NI и DTTI находится из соотношения скоростей прямой и обратной реакции: к = 9,5/38,0 = 0,25.
362
s
Таким образом, связь S-S в DTTI в четыре раза стабильнее связи
Cys-14—Cys-38 в нативной конформации молекулы БПТИ.
При свертывании и развертывании белка может иметь место внутримолекулярная реакция тиол-дисульфидного обмена, сопровождающаяся соответствующим конформационным переходом:
Наиболее стабильная геометрия дисульфидной связи отвечает двухгранному углу C-S-S-C (xs_s), равному ±90°. Все три S-S-связи в нативной конформации БПТИ имеют xs_s> близкий к оптимальному: -89° (Cys-5-Cys-55), -102° (Cys-14-Cys-38) и -88° (Cys-30-Cys-51). Барьер вращения вокруг S-S-связи составляет около 7,0 ккал/моль (Дж. Лове [70]; Р. Фразер и соавт. [71]; Н. Аллинжер и соавт. [72]), что значительно ниже барьера на пути развертывания белковой цепи. Поэтому конформационные превращения, связанные с изменением геометрии дисульфидной группировки при денатурации белка, происходят сравнительно легко. При восстановлении и реокислении связей S-S с использованием реакции тиол-дисульфидного обмена можно манипулировать скоростями превращений в любых направлениях, меняя концентрацию тиольной и дисульфидной форм реагента. Это имеет решающее значение не только при изучении кинетики процесса денатурации, но и для контроля энергии дисульфидных взаимодействий, что достигается путем изменения энергетического баланса между свернутой и развернутой формами белка. Кроме того, подбирая химическую структуру дисульфидного реагента под условия эксперимента, можно влиять на скорость дисульфидных взаимодействий вплоть до их прекращения у тех или иных промежуточных состояний.
12.2. ФИКСАЦИЯ, БЛОКИРОВКА И РАЗДЕЛЕНИЕ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СОСТОЯНИЙ
