Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
конформации NI свидетельствует легкость образования недостающей
связи S-S, объясняющаяся сближенностью остатков Cys-14 и Cys-38 SH ^
(для превращения NSH в N I требуется всего 10 мкс).
Полная схема кинетического пути обратимой денатурации белковой цепи БПТИ, полученная в результате детальных исследований Крейтона, представлена на рис. III.8. Последовательность событий между двумя предельными термодинамически стабильными состояниями бел-
370
рдавой молекулы (от D к N), описанными через дисульфидсодержащие |(етастабильные промежуточные состояния, изложена выше. Обратный рроцесс (от N к D) может быть инициирован добавлением дитиотреитола в восстановленной форме (DTT^). Он начинается с разрыва дисульфидной связи Cys-14-Cys-38. Образовавшийся первый
^егастабильный продукт NSH медленно, с периодом полураспада около * S н
.10 ч, и независимо от концентрации DTTSH переходит в ди-S-S-производные (30-51, 5-14) и (30-51, 5-38), которые трансформируются Э монодисульфидные продукты, на первых порах преимущественно содержащие (30-51) и (5-30). Процесс денатурации идет с неизмененным накоплением только состояния D. Таким образом, схема развертывания белковой цепи является, по существу, зеркальным отражением схемы свертывания цепи. Подбирая концентрации восстановленной и окисленной форм дитиотреитола, можно направлять процесс в ту или иную сторону и достигать или полностью развернутого
S
состояния белковой цепи (D), или нативной конформации белка (N I).
S
Константа равновесия, пропорциональная относительному содержанию двух форм DTT в третьей степени:
s"
N |
S
DTT
.SH
SH
DTT
может быть найдена экспериментально по легко измеряемым
s
концентрациям [NI] и [D]. С другой стороны, эту же константу можно
получить, учитывая все промежуточные состояния в ходе денатурации Или ренатурации и соответствующие константы скоростей Конформационных переходов и реакций тиол-дисульфидного обмена с Помощью дитиотреитола. Совпадение константы равновесия, рассчитанной Крейтоном, исходя из определенного механизма свертывания и развертывания белковой цепи, с величиной, найденной им непосредственно из эксперимента, свидетельствует в пользу результирующей кинетические схемы (рис. III.8), учитывающей правильно все этапы процесса и взаимоотношения между всеми промежуточными состояниями.
Равное содержание в растворе двух предельных структур белка, s s
N1 и D, получено при отношении DTT/DTTI, равном 1/26.
Следовательно, средняя стабильность трех дисульфидных связей в
S
нативной конформации БПТИ составляет 0,04 стабильности DTT I.
371
(30—51)
Рис. IH.8. Схема кинетического пути свертывания и развертывания белковой цепи БПТИ [59]
(30—51,14—38)
Рис. III.9. Изменение свободной энергии внутримолекулярных переходов в процессе свертывания и развертывания белковой цепи БПТИ (приведены относительные значения свободной энергии исходного (D), про-SH
межуточных (I, II, N§?{) и
5
конечного (NI) состояний)
S
Диаграмма (а) получена при использовании набора коистант скоростей при отношении
DTTO/DTjfjH _ 26/1, а
S
диаграмма (б)— 10^/1 [59]
Кинетический путь укладки и развертки полипептидной цепи БПТИ в общем виде записывается, согласно Крейтону, следующей формулой:
СО S
D <± (I) (II) <± NbSH <± N1,
где (I) и (II) - соответственно моно- и ди-Б-Б-промежуточные продукты. Для такого пути получен внутренне согласованный набор констант скоростей, в частности констант образования S-S-связей (к+2), величины которых характеризуют относительную стабильность соответствующих продуктов. По этим данным, используя уравнение
hk
AG = -RTln—х, kT
где R - универсальная газовая постоянная; Т - температура (в 372
где R - универсальная газовая постоянная; Т - температура (в абсолютной шкале); h - постоянная Планка; к - постоянная Больцмана; кг - константа скорости реакции, можно рассчитать относительную свободную энергию Гиббса и, таким образом, воспроизвести энергетический профиль свертывания и развертывания белковой цепи БПТИ (рис. III.9). Это было сделано Крейтоном для двух вариантов набора констант скоростей, один из которых получен при условии S SH ^
DTT I/DTTsh = 26, когда состояния D и N I изоэнергетичны (рис. III, 9,
s SH s
