Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
С. Шаффер [87], исследуя процесс ренатурации рибонуклеазы с помощью S-S-глутатиона, обнаружил, что образование моно- и ди-S-S-продуктов практически не сказывается на кривых кругового дихроизма, при последующем появлении и накоплении продуктов с большим числом дисульфидных связей они приближаются к спектру нативного белка. В связи с тем, что в данном случае изменения в спектрах кругового дихроизма, как и в случае изменений поглощения и флуоресценции, отмеченных Р. Хантгеном и соавт. [81], происходили раньше восстановления ферментативной активности рибонуклеазы, то, как полагает Крейтон, они связаны главным образом с формированием у три- и TeTpa-S-S-производных вторичных структур и гидрофобного окружения у ароматических остатков, а не с завершением образования нативной конформации. С. Шаффер и соавт. [88] исследовали влияние среды на скорость свертывания белковой цепи рибонуклеазы с использованием окисленного и восстановленного глутатиона. Обнаружено, что действие нейтральных солей на скорость ренатурации
377
Время, мин
симбатно их стабилизирующему влиянию на свернутое, состояние белка. Это позволило предположить, что в продуктивных промежуточных состояниях, последовательно переходящих по ходу ренатурации в нативную конформацию, реализуются преимущественно те же взаимодействия, что и в конечной структуре.
Выводы Чавеца и Шераги [86], как и Шаффера [87, 88], не,согласуются с результатами и более поздних исследований Крейтона и соавторов рибонуклеазы А [89, 90] и рибонуклеазы Т1 [91] методами, использованными при изучении БПТИ. Здесь также обнаруживаются промежуточные S-S-продукты, свидетельствующие о внутримолекулярной реорганизации дисульфидных связей по ходу ренатурации, такой же, как в случае трипсинового ингибитора. Не является в связи с этим неожиданным существование ферментов - дисульфидных изомераз, способствующих свертыванию БПТИ и быстрому образованию правильной системы дисульфидных связей [92, 93] (подробнее см. гл. 14).
12.5. РЕНАТУРАЦИИ ЛИЗОЦИМА
Много работ посвящено изучению ренатурации лизоцима, начавшемуся на современном уровне с исследования К. Эпштейна , и Р. Голдбергера [94]. Однако и в них, как и в случае рибонуклеазы, нет достаточной информации для однозначного ответа на вопрос об основных, принципиальных моментах механизма свертывания белковой цепи. Р. Брэдшоу и соавт. [95], а позднее В. Саксена и Д. Уетлауфер [67] использовали для изучения обратимой денатурации лизоцима реакцию тиол-дисульфидного обмена; последние стали проводить ее с
S-S-глутатионом. В. Сакседа и Д. Уетлауфер нашли, что сборка нативной конформации белка требует значительного количества восстановленного глутатиона, что является признаком образования промежуточных продуктов с неправильными, разрушаемыми на последующих стадиях ренатурации дисульфидными связями. Полупериод регенерации активного фермента составил при оцтимальных условиях около 5 мин. С. Ристоу и Д. Уетлауфер проанализировали смесь продуктов ранней стадии реоксидации лизоцима кислородом воздуха в присутствии ионов Си2+ [96]. Они обнаружили несколько продуктов метастабильных состояний с S-S-связями из 36 возможных в принципе и пришли к заключению о наличии немногочисленных путей свертывания белковой цепи.
У. Андерсон и Д. Уетлауфер проследили развитие процесса ренатурации лизоцима с помощью восстановленного и окисленного глутатиона [97]. Скорость образования дисульфидных связей, по их данным, опережает, точно так же, как у рибонуклеазы, восстановление ферментативной активности. Тем не менее авторы предположили прямой путь реставрации нативной конформации лизоцима только через продуктивные метастабильные состояния, не требующие переориентации дисульфидных связей. Однако выводы авторов о механизме сборки лизоцима нельзя считать достаточно обоснованными. В работе не были локализованы дисульфидные связи в продуктах, образованных
378
на разных стадиях процесса, не была исключена возможность создания межцепочечных S-S-связей и не приведены доказательства отсутствия таковых. Кроме того, нет уверенности в идентичности промежуточных продуктов, полученных в результате тиол-дисульфидного обмена и фиксированных блокировкой тиольных групп белковой цепи N-этилмалеимидом, так как до блокировки добавлялась мочевина (4 М), направляющая, как известно, процесс в обратную сторону с вероятным перераспределением связей S^-S.
А. Ачариа и Г. Таниучи [98] исследовали катализируемое ионами Си2+ окисление на воздухе восстановленного лизоцима с использованием гель-фильтрации для разделения промежуточных продуктов, находящихся на разных этапах сборки нативной конформации. Наибольшее внимание было уделено состояниям ранней стадии ренатурации. При этом, однако, были использованы заниженные концентрации йодаце-тата и в некоторых случаях добавлялась мочевина (6 М); несколько отличающиеся процедуры фиксации давали различные спектры улавливаемых продуктов, что указывает на неадекватность использованных методов. В работе тем не менее было показано, что содержание неправильно свернутого белка растет с увеличением скорости окисления. В своей следующей работе Ачариа и Таниучи [99] попытались определить положения остатков Cys в цепи лизоцима, образующих дисульфидные связи в промежуточных состояниях, обязательных для укладки физиологически активной трехмерной структуры лизоцима. С этой целью остатки цистеина последовательно подвергались необратимому блокированию. Однако никаких данных, подтверждающих наличие продуктивных метастабильных продуктов, получено не было. Т. Крейтон, анализируя эту работу, полагает, что окисление денатурированного белка в течение полутора суток кислородом воздуха в присутствии меркаптоэтанола вряд ли отвечает условиям, требуемым для решения поставленной задачи [59].
