Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Попов Е.М. -> "Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка" -> 180

Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.

Попов Е.М. Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка — М.: Наука, 1996. — 480 c.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка): problemabelkat21996.djvu
Предыдущая << 1 .. 174 175 176 177 178 179 < 180 > 181 182 183 184 185 186 .. 232 >> Следующая

поведении рибонуклеазы и БПТИ. При введении DTTI moho-S-S-продукты первого и второго белка образовывались примерно с
374
одинаковой скоростью. Далее, однако, картина менялась: ди-S-S-npo-дукты появлялись медленнее, а продукты с тремя и четырьмя дисульфидными связями вообще не обнаруживались. Все это наглядно иллюстрируется рис. III. 10, изображающим элетрофоретическое разделение промежуточных продуктов рибонуклеазы, блокированных йода-цетамидом (а) и йодацетатом (б). Полосы (I) и (II) на рис. III. 10 отвечают состояниям с одной и двумя S-S-связями. При обсуждении аналогичных данных по БПТИ отмечалось, что электрофоретическая подвижность продуктов, фиксированных йодацетамидом, определяется лишь формой молекул. В связи с этим отсутствие разрешения полосы D на компоненты и наблюдающееся только ее расширение (рис. ШЛО, а) свидетельствуют о близости конформационных состояний рибонуклеазы с одной и двумя S-S-связями к состоянию D, т.е. к статистическому клубку. У молекул БПТИ, аминокислотная последовательность которой более чем в два раза короче последовательности рибонуклеазы, этого не происходит (рис. III.10, б)\ из рис. III.10 видно, что заметное различие в конформационных состояниях белковой цепи имеет место даже среди отдельных MOHO-S-S-продуктов.
Полученные Крейтоном результаты по ренатурации рибонуклеазы s
с реагентом DTTI свидетельствуют о том, что через 30 мин после запуска процесса в образующейся смеси накапливаются при частичном сохранении состояния D только моно- и ди-8-8-продукты; образование третьей дисульфидной связи в этих условиях не происходит [83, 85]. Следовательно, экспериментальные данные по реокислению БПТИ и рибонуклеазы не согласуются с распространенным представлением о таком пути свертывания белка, при котором образование одной правильной дисульфидной связи автоматически приводит к сближенности остатков цистеина, образующих между собой следующую и также правильную дисульфидную связь и т.д., вплоть до конформации Ns{{, близкой к нативной, в которой сближены последние свободные остатки Cys.
Более быстрое образование третьей и четвертой дисульфидных связей происходит при использовании в качестве дисульфидного реагента окисленного глутатиона (S-S-глутатиона). Однако, как видно из рис. III. 11, и в этом случае ренатурация не достигает состояния N. Рибонуклеаза принимает полностью нативную конформацию после медленного внутримолекулярного перераспределения S-S-связей в три-S-S-продуктах (III) и последующего тиолкатализируемого перераспределения TeTpa-S-S-продуктов (IV). Полупериоды конформационных переходов, завершающихся образованием промежуточных продуктов с одной (I), двумя (И), тремя (III) и четырьмя (IV) дисульфидными связями, согласно Крейтону, равны 2 • 10~3, 3 • 10_3, 1 и 20 с соответственно [83-85]. Следовательно, образованные вначале у восстановленной рибонуклеазы дисульфидные связи не только не благоприятствуют образованию следующих, а, напротив, препятствуют этому. В процессе ренатурации БПТИ полупериоды накопления
375
л
Рис. ШЛО. Денситометрические кривые электрофоретического разделения молекул, фиксированных йодацетамидом (а) и йодацетатом (б) в процессе ренатурации панкреатической рибонуклеазы с использованием в качестве дисульфидного реагента дитиотреитола [83]
S
Рис. Ш.11. Денситометрические кривые электрофоретического разделения молекул, фиксированных йодацетамидом (а) и йодацетатом (б) в процессе ренатурации панкреатической рибонуклеазы с использованием в качестве дисульфидного реагента окислительного глутатиона (S—S-глутатион) [83]
промежутоных продуктов (I) и (II) имеют тот же порядок, что и у рибонуклеазы, а продукты с тремя S-S-связями (III) - 12 мкс. Укладка белковой цепи БПТИ in vitro, если судить по метастабильным промежуточным состояниям с дисульфидными связями, менее беспорядочна, чем у рибонуклеазы, поскольку MOHO-S-S-продукты у этого белка более компактны, а скорость образования продуктов с двумя дисульфидными связями больше, чем с одной. Энергетические барьеры укладки БПТИ, по-видимому, также ниже, так как ее ди-Б-Б-продукты быстро перехо-
sh
дят в конформацию NSH, близкую к нативной, а у рибонуклеазы время перегруппировки S-S-связей более продолжительно и, кроме того, сам процесс затрагивает продукты, имеющие насыщенные системы дисульфидных связей.
376
Рис. 111.12. Кинетика восстановления антигенной активности рибонуклеазы в jgg процессе ренатурации
Использованы антитела, узнающие участки:
1 — (1 —13), 2 (31—79), 5 (80—124) белковой gg
глобулы [86]
С
JI. Чавец и Г. Шерага [86] | 00
предприняли попытку просле- ^
дить за возникновением натив- ^ ^
ноподобной конформации рибо- § нуклеазы в процессе ее реокси- | дации на воздухе, воспользо- | 20 вавшись иммунохимическими ^ методами. Они получили набор 0
антител, узнающих в трехмерной структуре белка фрагменты 1-13, 31-79 и 80-124, и с их помощью исследовали кинетику восстановления антигенной активности по ходу ренатурации рибонуклеазы. Результаты, представленные на рис. III. 12, показывают неизменное увеличение активности со временем, последовательность и постоянную направленность сборки трех выбранных фрагментов в сторону нативной конформации рибонуклеазы. JI. Чавец и Г. Шерага пришли к заключению, не согласующемуся с данными Т. Крейтона по ренатурации рибонуклеазы и отчасти БПТИ, проведенной, правда, в иных условиях. На основе результатов иммунохимического анализа они представили механизм ренатурации белка, исключающий образование промежуточных продуктов, прямо не приближающих свертывание полипептидной цепи к конечной физиологически активной трехмерной структуре. По их мнению, процесс ренатурации рибонуклеазы представляет собой строго упорядоченное, последовательное формирование структурных элементов. нативной конформации белка.
Предыдущая << 1 .. 174 175 176 177 178 179 < 180 > 181 182 183 184 185 186 .. 232 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed