Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
На рис. III.7 приведены денситометрические кривые электрофоретического разделения молекул БПТИ, блокированных йодацетамидом (а) и йодацетатом (б) в процессе медленной ренатурации. Сначала весь блок находился в состоянии D, которому отвечает в обоих случаях единственный резкий максимум плотности. При ренатурации и гашении реакции тиол-дисульфидного обмена через 1, 3. ..., 25 мин интенсивность полосы D постепенно уменьшается, а полосы N -увеличивается. На первой минуте ренатурации возникают и в течение 10-15 мин устанавливаются пики плотности промежуточных продуктов А. В и С. Близкое расположение пиков промежуточных продуктов друг к другу и к пику D свидетельствует, что они отвечают белковым молекулам, имеющим одну дисульфидную связь и отличающимся друг от друга формой.
Этим же методом Крейтон [741 при иных кинетических условиях ренатурации получил промежуточные продукты с двумя дисульфид-ными связями. Самого лучшего разделения промежуточных состояний белковой цепи он достиг с помощью ионообменной хроматографии, используя блокировку йодацетатом. Разрешающая способность метода позволила одновременно наблюдать за кинетикой продуктов с одной и двумя дисульфидными связями. Всего между пиками состояний D и N Крейтон обнаружил восемь пиков метастабильных состояний белковой 366
Рис. Ш.7. Денситометрические кривые электрофоретического разделения молекул, фиксированных йодацетамидома (а) и йодацетатом (б) в процессе ренатурации восстановленного белка БПТИ [59]
цепи БПТИ. Ионообменная хроматография была использована для выделения промежуточных продуктов и их разделения по числу дисульфидных связей. Идентификация самих же связей в последовательности БПТИ производилась после протеолитического расщепления белка на фрагменты методом диагонального электрофореза.
12.3. КИНЕТИЧЕСКИЙ ПУТЬ РЕНАТУРАЦИИ
ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО ТРИПСИНОВОГО ИНГИБИТОРА
После обнаружения целой гаммы промежуточных состояний на пути от полностью денатурированного белка к нативному Крейтон детально изучил' кинетику изменений и взаимопревращений этих состояний в ходе свертывания и развертывания белковой цепи. Далее он выяснил оптимальные условия моментальной остановки процесса ренатурации БПТИ и гашения тиол-дисульфидной реакции обмена, а затем разработал способы фиксации и выделения промежуточных состояний, определения у них количества дисульфидных связей и мест их локализации в аминокислотной последовательности БПТИ. Таким образом, последующее изучение денатурации белка, а именно получение количественных данных о кинетике и термодинамике всех этапов процесса и доказательное описание механизма самоорганизации пространственной структуры белка in vitro, имеет серьезную основу, созданную Крейтоном в результате огромной целенаправленной подготовительной работы.
Для выяснения пути перехода промежуточных продуктов друг в
367
друга путем образования, разрушения и перераспределения дисульфидных связей были использованы два линейных дисульфидных реагента (гидроксиэтилдисулъфид и окисленный глутатион) и один циклический реагент (дитиотреитол). Предварительно было выяснено, что разрушение трех дисульфидных связей БПТИ приводит к состоянию, в котором нативно подобные структурные элементы практически не обнаруживаются [75, 76]. Процесс ренатурации полностью восстановленной молекулы БПТИ (D) начинается с образования начальной дисульфидной связи с линейными дисульфидными реагентами. Это происходит быстро и в строгом соответствии с реакцией второго порядка, что указывает на большую скорость внутримолекулярных переходов (k+2 > 1 с4).
В образовании первой S-S-связи принимают участие все шесть остатков Cys, активность которых практически одинакова и близка к активности простых модельных тиолов. Из 15 возможных промежуточных состояний с одной дисульфидной связью накапливаются только два независимо от времени ренатурации, природы и концентрации дисульфидных реагентов. Один продукт с S-S-связью (30-51) неизменно составляет 60-70%, а другой - (5-30) - 20-30%; в минорную часть (менее 10%) входят продукты (5-51) и (30-55). Избирательность в накоплении монодисульфидных производных при первоначально эквивалентном состоянии всех остатков Cys и генерации беспорядочного набора моно-S-продуктов полностью денатурированным белком указывает на высокие скорости перераспределения взаимодействующих остатков Cys посредством тиол-дисульфидной реакции обмена. Нестатистичносгь обменов, т.е. наличие определенной направленности, обусловлена, по-видимому, меняющимися конформационными свойствами свертываемой полипептидной цепи. Переход беспорядочного спектра MOHO-S-S-продуктов, генерируемого гуанидингидрохло-ридом, в упорядоченный совершается при доведении pH раствора до нормального значения (- 0,7) за несколько секунд.
Т. Крейтон показал, что после обработки денатурантом все 15 монодисульфидных продуктов присутствуют в растворе в равных концентрациях и, следовательно, изоэнергетичны. Улавливание их осуществляется переводом тиольных групп в неактивную, незаряженную, форму подкислением среды. После удаления денатуранта при сохранении низкого значения pH связи S-S не остаются равными. При повышении pH и переводе SH-групп в активную форму наступают избирательное перераспределение дисульфидных связей и накопление в растворе в основном только продуктов (30-51) и (5-30). Исключение составляет производное (5-55), которое не меняет своей позиции и не конвертирует в нормальные моно-З-продукты (30-51 и 5-30). Оно не образуется в нормальных условиях ренатурации и обнаруживается лишь с введением денатурирующего агента. Факт участия всех шести остатков Cys в образовании двух основных MOHO-S-S-продуктов был подтвержден Крейтоном при наблюдении закономерного падения скорости увеличения их концентрации при последовательной необратимой блокировке остатков 14-38 и 5-55 белка в состоянии D. 368
