Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Тиол-дисульфидная реакция обмена, благодаря которой образуются, разрушаются и обмениваются остатками Cys дисульфидные связи, может быть быстро прекращена добавлением реагента, взаимодействующего со свободными сульфгидрильными группами и тем самым блокирующего их. Чаще всего такими реагентами являются йодацетат и йодацетамид, реакция которых с тиолами проста и необратима. Согласно Крейтону [73J, при pH 8,7 она протекает с константой скорости второго порядка от 2 до 5 с-1 ¦ моль4, так что при добавлении
363
a sh /
Рис. III.5. Схема экспериментального подхода к исследованию структуры промежуточных состояний процесса свертывания белка с использованием дисульфидных связей
а — гипотетический путь свертывания полипептидной цепи с шестью остатками цис-теина; б — фиксированные промежуточные состояния; t^, tj, tjj, tN — времена блокирования тиолдисульфидного обмена соответственно у денатурированного белка (D), промежуточных продуктов с одной (I) и двумя (II) дисульфидными связями и у нативного белка (N) [73]
364
fnc. III.6. Кинетика гипотетического процесса свертывания белка с шестью остатками цистеина Обозначения см. рис. III.5. [73]
в раствор одного из этих реагентов с концентрацией 0,1 М реакция тиол-дисульфидного обмена полностью гасится за несколько секунд. S-S-связи, существовавшие до момента гашения, стабилизируются в отсутствие необходимого донора электронов, не обмениваются остатками Cys и не разрушаются. Таким образом, практически моментально по равнению со скоростью медленной ренатурации (десятки минут) останавливаются все процессы, связанные с взаимодействием боковых цепей остатков цистеина, фиксируются образовавшиеся до гашения дисульфидные связи и создаются идеальные условия для выделения и изучения содержащих эти связи промежуточных продуктов свертывания белковой цепи из полностью денатурированного состояния в дативную конформацию.
На рис. III.5 представлены основные этапы предполагаемого пути свертывания белковой цепи, содержащей шесть остатков Cys и имеющей в окончательной глобулярной структуре три дисульфидных мостика. На рис. III.6 приведены кинетические кривые денатурированного и нативного состояния белка и двух промежуточных метастабильных состояний с одной и двумя дисульфидными связями. Эти кривые, также гипотетические, иллюстрируют кинетику изображенного на рис. III.5 механизма укладки белковой цепи с точки зрения S-S-связей. При гашении реакции тиол-дисульфидного обмена к моменту времени tD все мо-иекулы белка будут стабилизированы в развернутой форме. К моменту ti наибольшее количество молекул будет содержать одну дисульфидную связь, а к tn - две. Следовательно, времена tj и tn - наиболее подходящие для прекращения взаимодействий остатков Cys и выделения вакопившихся промежуточных продуктов I и П. Конформационный переход между двумя формами состояния II (на рис. IH.5 указан пунктир-вой стрелкой) совершается столь быстро, что не влияет на другие процессы.
Возможность фиксировать и укладывать на разных этапах процесса свертывания белковой цепи промежуточные состояния с устойчивыми дисулифидными связями делает реальным их выделение, очистку и всестороннее исследование структурных, термодинамических и кинетических характеристик. Промежуточные продукты отличаются друг от Чруга формой и молекулярным объемом хотя бы в силу разного числа
365
дисульфидных связей, а также гетерогенностью, вносимой реагентом X, реакцией гашения (блокировки).
Различие в конформационных свойствах и зарядах дает возможность эффективнее использовать для разделения фиксированных продуктов гель-электрофорез, в особенности при малых значениях pH когда становятся стабильными обусловленные кислотой промежуточные продукты. Молекулы БГТТИ с полностью и частично восстановленными остатками Cys (состояния D, I и И), блокированные йодацетатом, мигрируют к катоду медленнее по сравнению с молекулами в тех же состояниях, блокированными йодацетамидом или кислотой, из-за соответственно шести, четырех и двух отрицательно заряженных ацетатных групп. В свою очередь, молекулы в состояниях D, I и II с нейтральными блок-группами ацетамида и кислоты имеют тот же заряд, что и молекула белка в нативном состоянии. Более медленная скорость их перемещения к катоду по сравнению с N обусловлена большей рыхлостью форм. Таким образом, скорость миграции белка, фиксированного йодацетатом, определяется как зарядом, так и формой, а белка, фиксированного йодацетамидом или кислотой, - только формой. Если предположить одинаковое конфор-мационное влияние блокирующих реагентов йодацетата и йодацета-мида, то форма белка будет коррелировать только с числом дисульфидных связей, которые при этом условии можно определить сравнением скоростей миграций одного и того же продукта, фиксированного как йодацетатом, так и йодацетамидом, со скоростью миграции белка в состояниях D или N. Измеряя денситометром плотность в геле и наблюдая за ее изменением во времени, можно составить представление о кинетике свертывания белковой цепи.
