Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Рис, 6. Система для образования линейного градиента концентрации ПААГ в трубках
пачка трубок; 2— перистальтический насос; 3 — смеситель градиента
Выше уже упоминалось о возможности использования градиента пористости геля с изменяющимся по его длине, т. е. по высоте трубки, содержанием акриламида. Были также приведены соображения, касающиеся подбора концентраций инициирующих добавок в этом случае. Преимущества таких «градиентных» гелей будут рассмотрены ниже. Для получения градиентных гелей используют такие же смесительные устройства, как при создании градиентов плотности сахарозы для ультрацентрифугирования. В этом случае также можно получать линейные и нелинейные градиенты, «выпуклые» и «вогнутые», в том числе экспоненциальные.
В смеситель можно поместить раствор мономеров с максимальным содержанием акриламида, а в резервуар смесительного устройства — соответственно разбавленный раствор. Затем можно заливать закрытую снизу трубку по стенке подобно центрифужной пробирке, однако это довольно неудобно ввиду малого объема трубки (2—4 мл). Кроме того, почти всегда желательно иметь несколько трубок с заведомо одинаковой формой градиента, поэтому лучше заливать одновременно целую пачку параллельно расположенных трубок. Всю пачку, скрепив ее резинками, закрепляют вертикально в стакане таким образом, чтобы нижние торцы трубок были слегка приподняты над его дном. Через отросток, припаянный у дна стакана (или через одну из трубок), насосом подают градиент смеси мономеров (рис. 6). Заполнение трубок идет снизу вверх, поэтому в смесителе градиентного устройства должен находиться раствор мономеров малой концентрации, а в резервуаре — концентрированный раствор. В него следует добавить до 10% сахарозы, чтобы по мере поступления в стакан с трубками плотность жидкости заметно увеличивалась одновременно с повышением содержания акри-ламида. Это обеспечит равномерное оттеснение менее концентрированных слоев вверх по трубкам. По окончании заполнения в каждую трубку следует наслоить одинаковое (и минимально необходимое) количество воды или изобутанола. Еще лучше начинать заполнение трубок с воды, а в раствор мономеров, находящийся в смесителе, добавить 2% сахарозы.
Следует помнить о необходимости промывки смесительного устройства и системы подачи растворов в стакан сразу после окончания их использования, до того как в них произойдет полимеризация акриламида. Разумеется, для этого всю систему нужно отсоединить от стакана, зажав предварительно подводящую к нему трубку.
По окончании полимеризации всю пачку трубок следует извлечь из стакана, разнять, с каждой удалить гель (снаружи) и обрезать его излишек у нижнего конца. Возможно, хотя технически и более сложно, создание линейного градиента ПААГ за счет перемешивания двух одинаковых по высоте слоев раствора мономеров разной концентрации в наклонном положении [Lo-rentz, 1976].
В описанном приборе для вертикального электрофореза электрическая цепь надежно замыкается непосредственными контактами обоих концов трубок с электродными буферами. Однако надо следить за тем, чтобы на нижних торцах гелей не было пузырьков воздуха, оставшихся там с момента погружения трубок в нижний резервуар. Пузырьки можно удалить струей жидкости, направленной из шприца с согнутой иглой.
По окончании электрофореза гель из трубки извлекают. В большинстве случаев это легко сделать с помощью длинной и затупленной иглы шприца, которую вводят с одного из концов трубки, круговыми движениями постепенно отслаивая гель от ее стенок. Если необходимо, такую операцию повторяют и с другого конца. Через иглу при этом поступает вода из закрепленного несколько выше иглы резервуара (или от насоса). Если гель отслаивается с трудом, в воду можно добавить 0,5—1% какого-нибудь детергента. Во избежание поломки следует дать гелю возможность выскользнуть из трубки в сосуд с водой, над которым проделывают описанную манипуляцию. Иногда для удаления геля из очень длинных трубок по его периферии с концов трубки впрыскивают глицерин, а сам гель выталкивают водой из присоединяемого к трубке шприца. Если гель высокой концентрации вынуть не удается, его приходится замораживать, а трубку разбивать молотком. Иногда можно решить проблему путем вымачивания трубки с гелем в метаноле: гель постепенно съеживается и отстает от стенки.
Основным недостатком электрофореза в трубках является затрудненный отвод тепла даже при диаметре 5 мм. На оси геля температура оказывается выше, чем у его прилегающей к стеклу поверхности. Это приводит к изгибу зон и соответственно окрашенных полос, поскольку электрофоретическая подвижность зависит от температуры. В условиях хорошего теплоотвода можно вести микроэлектрофорез в стеклянных капиллярах диаметром 0,7—1,5 мм {Condeelis, 1977].
Для электрофореза белков обычно используют пластины шириной 8—14 см и длиной (в направлении электрофореза) 8— 28 см. Электрофорез нуклеиновых кислот и их фрагментов, например при секвенировании, нередко ведут в больших пластинах размером 33X43 см, что диктуется максимальным размером рентгеновской пленки для авторадиографии. Для разделения гидролизатов тРНК Пиртл и др. недавно использовали пластины ПААГ длиной 90 см [Pirtle et al., 1980].
