Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 13

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 7 8 9 10 11 12 < 13 > 14 15 16 17 18 19 .. 130 >> Следующая

Когда гель готов, вынимают нижнюю прокладку или снимают липкую ленту и осторожно вытаскивают гребенку. При работе с концентрированным ПААГ гель может прилипать к зубцам гребенки и нижние плоскости карманов могут оказаться неровными. Это ухудшает условия формирования исходных полос в геле.
В таком случае имеет смысл ввести еще один слой геля пониженной концентрации и гребенку устанавливать в него. На границе между двумя слоями разной пористости полоса исходного препарата будет выгодным образом сужаться.
Перегородки между близко расположенными карманами в агарозе малой концентрации могут оказаться непрочными. Описан вариант формы, в которой одну из пластин изготавливают из плексигласа с рядом фрезерованных узких перегородок в ее верхней части, выступающих на всю толщину зазора между пластинами. Гребенку вставляют между этими перегородками, но не на всю их длину. Зубцы гребенки хорошо подогнаны по ширине интервалов между перегородками, так что форма оказывается уплотненной с ее будущего верхнего края. Перевернув форму, заливают агарозу с противоположной стороны. После застывания агарозы и удаления гребенки карманы для препаратов оказываются разделенными перегородками из плексигласа, концы которых погружены в гель [Sugden et al., 1975].
Для получения пластин с градиентом пористости геля по высоте используют те же приемы, что описаны выше. Для одной пластины смесь подают на дно формы через тонкую стеклянную трубку, прижатую к боковой прокладке. Разумеется, в этом случае смеситель градиентного устройства должен содержать смесь мономеров малой концентрации, а резервуар — более концентрированную смесь с добавкой сахарозы. Чтобы не нарушить градиента при вынимании трубки, ее можно оставить в полимери-зующемся геле.
Рис. 7. Форма для полимеризации вертикальной пластины геля
/ — стеклянные пластины; 2 — прокладки; 3— гребенка; 4 —зажим
Возможно одновременное заполнение целой стопки открытых снизу форм для геля (без нижних прокладок), которое проводят в сосуде прямоугольной формы, как описано выше для пучка трубок. Фирма «Pharmacia» (Швеция) предлагает для этой цели специальный сосуд прямоугольного сечения, где два любых набора могут быть зажаты с помощью клиньев, скользящих по ДЕум наклонным плоскостям. Градиент концентрации акриламида подают на дно каждого из двух отделений сосуда через отдельные штуцеры. На фотографии (рис. 8) в сосуд установлена только одна пачка пластин. Бесполезный расход акриламида и загрязнение им пластин снаружи при использовании такого сосуда сведены до минимума. Подобного рода устройство из плексигласа для пластин любого размера легко изготовить в лаборатории. Кстати, в нем удобно заливать и обычные, не градиентные гели. Еще проще стопку пластин с боковыми прокладками безо всякой герметизации поместить в полиэтиленовый мешок, плотно обернуть его вокруг пластин, зажать всю стопку и залить обычный гель прямо в мешок. После полимеризации мешок снимают, а излишки геля с нижних концов пластин обрезают [Kerckaert, 1978].
Линейный градиент пористости геля в пластине или трубках можно создать смешиванием двух слоев растворов мономеров разной концентрации путем многократного переворачивания пластины или трубок в наклонном положении.
В литературе описано много конструкций приборов для электрофореза в вертикальных пластинах. Ряд моделей предлагают различные фирмы. Наибольшее распространение получила конструкция прибора из плексигласа, предложенная Стадиером (рис. 9) [Studier, 1973]. Ее легко реализовать и в лабораторных условиях. Верхний и нижний электродные резервуары прямоугольной формы соединены вертикальной стенкой, в которой имеется вырез, ведущий в полость верхнего резервуара. Такой же вырез имеет одна из двух стеклянных пластин, между которыми полимеризуется гель. Пластины прижимают пружинными зажимами к вертикальной стенке так, чтобы оба выреза совпали. Буфер в верхний резервуар заливают до такого уровня, чтобы он через вырез покрывал верхний торец геля. При этом вторая, не вырезанная, стеклянная пластина выступает в роли передней стенки резервуара. В месте совмещения двух вырезов, между стеклянной пластиной и стенкой, должно быть осуществлено уплотнение, препятствующее вытеканию верхнего буфера. Стадиер использовал для этой цели заливку агаром. Фирма «Bio-Rad» в своих моделях 220 и 221 использует ту же конструкцию, но обеспечивает уплотнение с помощью резиновой прокладки.
В оба резервуара вмонтированы электроды из платиновой проволоки. При установке в прибор форму с гелем частично погружают в буфер нижнего резервуара, так что она опирается там на разнесенные по сторонам выступы и ее нижний торец
20
Рис. 8. Сосуд для формирования градиента концентрации ПААГ в пластинах (фирмы «Pharmacia»)
оказывается приподнятым над дном резервуара. После погружения надо внимательно проверить, не осталось ли между пластинами и на торце геля пузырьков воздуха. Их можно удалить струей жидкости из согнутой иглы шприца.
Препараты с добавленной в них сахарозой или глицерином вносят в карманы геля после окончательной сборки прибора так же, как и в трубки, т. е. подслаивают их под электродный буфер на дно каждого из карманов. Их можно заполнять препаратом (постепенно поднимая кончик пипетки) почти на полную высоту. Приемы заполнения были описаны выше.
Предыдущая << 1 .. 7 8 9 10 11 12 < 13 > 14 15 16 17 18 19 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed