Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 9

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 3 4 5 6 7 8 < 9 > 10 11 12 13 14 15 .. 130 >> Следующая

Контакт с кислородом воздуха не мешает застыванию агарозы, поэтому плоские гели для горизонтального электрофореза готовят путем заливки дозированного объема расплавленной агарозы на строго горизонтальную стеклянную пластинку нужного размера. Тем не менее горячую смесь агарозы с буфером имеет смысл кратковременно деаэрировать под вакуумом.
Выбор концентрации агарозы, т. е. пористости ее геля, диктуется размерами фракционируемых макромолекул. Средний размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответствует диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием агарозы используют для гель-фильтрации. При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом
поле за счет трения, поэтому для электрофореза применяет агарозные гели с концентрацией 0,4—2%. Ниже для ориентировки представлены примерные концентрации гелей агарозы (в %) для некоторых распространенных объектов фракционирования: Высокомолекулярная ДНК вирусов и плазмид 0,4
Рестрикты ДНК (5—20 тыс. пар оснований) 0,7
мРНК, Денатурированная обработкой метилртутью 1,0
Реовирусная двунитевая РНК (500—5000 пар оснований) 1,5
Рибосомная РНК 1,75
Нативные мРНК; рестрикты ДНК (100—1000 пар оснований) 2,0
Перед заливкой в форму или на пластину раствор горячей агарозы охлаждают до 50° и выдерживают не менее 1 ч в термостате при данной температуре. Это необходимо для полного выравнивания температуры раствора по всему его объему, чем обеспечивается одновременное застывание всего геля и однородность его структуры.
СМЕШАННЫЙ ГЕЛЬ (АГАРОЗА+ПААГ)
Электрофорез крупных белков иногда бывает целесообразно вести в крупнопористом ПААГ, содержащем 1,5—2,5% акриламида. Для придания прочности такому гелю его полимеризуют совместно с 0,5—0,6% агарозы. Имеет место своеобразный «симбиоз»: чистая 0,5%-ная агароза, застывая, дает очень мягкий гель, 2%-ный ПААГ не удается даже заполимеризовать, а их комбинация образует гели с отличными* механическими характеристиками.
Пространственная сетка агарозы в силу указанных выше причин имеет гораздо более крупные поры, чем полимеризую-щийся внутри этой сетки ПААГ, и мало влияет на электрофоретическую подвижность белков, зато образует жесткий каркас, придающий необходимую прочность гелю в целом. Для образования такой структуры надо обеспечить условия, при которых агароза затвердевает раньше, чем полимеризуется ПААГ. Исходя из этого, подбирают концентрацию персульфата аммония и ТЕМЕД.
Агарозу растворяют в буфере с учетом последующего разбавления, прогревают, как описано выше, и'выдерживают в течение часа при 50°. При этой же температуре добавляют соответствующий раствор мономеров акриламида, быстро деаэрируют смесь, вносят инициирующие добавки и немедленно заливают между подогретыми до 37° стеклами. Сначала застывает агароза; полимеризация акриламида обнаруживает себя появлением границы, лежащей на 2—5 мм ниже края геля агарозы. Для обеспечения формирования узкой начальной полосы препарата при вступлении его. в гель имеет смысл спустя час после окончания полимеризации ПААГ снять одну стеклянную пластину и обрезать гель ниже границы полимеризации акриламида. Затем можно снова наложить пластину, зажать гель, и зэ-
лить пбверх него 0,3%-ную чистую агарозу, в которой и формировать карманы» для внесения препаратов [Schwingnamer, Shepherd; 1980].
В качёстве примера можно назвать успешное разделение путем электррфореза в смешанном геле (1,7% ПААГ+0,5 агарозы) полисом печени мыши от мономеров до пентамеров [Nishi-naga, Yamamoto, 1980].
АЦЕТАТЦЕЛЛЮЛОЗНАЯ ПЛЕНКА, ИМПРЕГНИРОВАННАЯ ПААГ
Вместо агарозы можно использовать жесткую, крупнопористую пространственную сетку ацетатцеллюлозы. Полоску этого полимера сначала помещают на поверхность раствора, где она смачивается, а затем погружают в раствор мономеров акриламида с инициирующими добавками. ПААГ полимеризуется во всем объеме раствора, а также полоски целлюлозы. По окончании полимеризации гель с поверхности полоски можно отслоить и отмыть. Таким способом нетрудно получить «пластинку» толщиной 0,1 мм. Конец полоски следует оставить свободным от геля (не погружать). На него удобно наносить исходный белковый препарат, который легко впитывается в ацетатцеллюлозу [Frenkel, Blagrove, 1978].
Глава 2
ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГЕЛЕЙ И АППАРАТУРА
Рассмотрим основные технические приемы приготовления и использования гелей для электрофореза. Это рассмотрение целесообразно провести отдельно для трех вариантов аналитического электрофореза: вертикального в трубках, вертикального в пластинах и горизонтального в пластинах. Приемы препаративного электрофореза будут рассмотрены отдельно. Методы подготовки препаратов, выбора буферов и различных добавок к ним, а также условий протекания самого процесса электрофореза будут детально исследованы далее, в главах 3 и 4, посвященных описанию различных вариантов электрофоретического фракционирования белков и нуклеиновых кислот.
Предыдущая << 1 .. 3 4 5 6 7 8 < 9 > 10 11 12 13 14 15 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed