Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Выбор значения Т зависит от природы различия электрофоретических подвижностей белков в геле. Если сильно различаются размеры молекул, а отношение заряда к массе у них более или менее одинаково, то имеет смысл выбрать Т максимальным. Разделение в этом случае будет происходить только за счет трения о гель, причем тем эффективнее, чем больше Г, хотя при этом в связи с увеличением продолжительности электрофореза усилится диффузия белкой. Если же компоненты анализируемой смеси имеют различные отношения заряда к массе, то может оказаться выгодным вести разделение в крупнопористом геле
(при малых значениях Т), т. е. как бы в свободной жидкости, почти не используя эффект трения молекул о гель. По/крайней мере, это обеспечит выигрыш во времени фракционирования.
Ориентировочно о характере различия электрофоретических подвижностей двух белков в данных условиях разделения можно судить в том случае, когда известны их молекулярные массы и изоэлектрические точки, а также содержаний в них ионогенных аминокислот. Чаще всего бывают, хотя бы/приблизительно, известны молекулярные массы. Если они различаются незначительно, то имеет смысл ориентироваться сначала на крупнопористый гель и попробовать поварьировать pH буфера.
Пожалуй, самый существенный вывод из проведенного качественного рассмотрения—заключение об определенной свободе выбора концентрации ПААГ и, особенно, содержания в нем «сшивки» (С в пределах 2—5). В любом случае выбор значений Т должен быть сделан на основе ряда пробных опытов, в которых, в частности, следует варьировать pH буфера и продолжительность электрофореза (электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия пока не рассматривается).
В качестве сугубо ориентировочной можно рекомендовать следующую полученную на практике таблицу соответствия молекулярных масс разделяемых белков (М) и концентраций ПААГ (7):
разделяемых белков (М) и
М.тж. _ М, ТЫС. Т. %
Дальтон 1 • л Дальтон
Ю-40 15-20 100-300 5-10
40-100 10-15 >300 5
Приступая к электрофоретическому фракционированию биополимеров, необязательно в точности воспроизводить значения Т и С, приведенные в литературе для сходного типа экспериментов, но выбранные однажды условия следует, разумеется, точно воспроизводить в собственной серии опытов для надежной идентификации и сопоставления положения соответствующих полос.
АГАРОЗА
Сочетание прочности и крупнопористости делает гели агарозы незаменимыми при электрофорезе особенно крупных макромолекул, в частности нуклеиновых кислот. Агароза—это особо чистая фракция природного линейного полисахарида агара, который извлекают из некоторых видов морских водорослей. В полимерной цепи агарозы чередуются p-D-галактопираноза и 3,6-ангидро-а-?-галактопираноза. Молекулярная масса ее составляет 10*—105. Гелеобразование идет, как уже указывалось, путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы образуют прочные гели уже при концентрации 0,3%.
При\ температурах 84—96° (а у специальных типов —уже при 70°)\ раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость — «плавится». Вязкость расплавленного 1 % -ного раствора агарозы составляет 10—15 сП, что примерно соответствует вязкости 50%-ного раствора сахарозы «ри комнатной температуре. Растворы агарозы характеризуются ярко выраженным гистерезисом: они затвердевают, образуя гель, при значительно более низких температурах (36—42°). У легкоплавких типов агарозы эта температура снижается до 30°. Такая особенность облегчает манипуляции с расплавленной агарозой — можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную на кипящей бане агарозу предварительно охлаждают до 50—55° и уже при этой температуре дозируют и заливают в формы; это удобно и не связано с возникновением значительных тепловых деформаций.
t Гели агарозы не вполне прозрачны, однако это обусловлено не наличием примесей, а своего рода «кристаллизацией» геля и свидетельствует, скорее, о чистоте агарозы. Затвердевший гель представляет собой не вполне равновесную систему: со временем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жидкость. Этот процесс идет вначале довольно быстро, а потом — очень медленно. Тем не менее гели агарозы перед опытом следует выдерживать в течениегпо крайней мере, 12 ч (открытые пластины для горизонтального электрофореза выдерживают во влажной камере). Сжатие сильнее выражено у более концентрированных гелей агарозы.
Температуры плавления и гелеобразования зависят от содержания в агарозе метоксильных групп, которое может достигать 3—4%. Наличие этих групп затрудняет гелеобразование. В агарозе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Их присутствие существенно влияет не только на температуры плавления и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза. В частности, именно эфиры серной кислоты обусловливают сильно выраженное при электрофорезе в гелях агарозы явление эндосмоса, сущность которого сводится к следующему.
