Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Полимеризацию акриламида или застывание агарозы, а затем и сам электрофорез ведут в форме, образованной двумя пластинами зеркального стекла толщиной 5—6 мм. Расстояние между пластинами задается толщиной прокладок из тефлона или плексигласа («спейсеров») и определяет толщину геля. Прокладки шириной 10—15 мм устанавливают вдоль боковых краев стекол. Для аналитических целей, как правило, используют пластины геля (и соответственно прокладки) толщиной от 0,4 до 1,5 мм. Эти же прокладки можно использовать и для уплотнения формы во время нахождения в ней еще не затвердевшего геля. Для этого устанавливают еще одну прокладку точно такой же толщины (фрезеровать совместно!) по нижнему краю стекол и плотно прижимают ее к фрезерованным торцам боковых прокладок.
Хорошо подогнанные тефлоновые прокладки в силу гидро-фобности материала можно не смазывать. Прокладки из плек-сиглаза смазывают силиконовой смазкой. Тонкий валик смазки из шприца без иглы наносят сначала с одной стороны трех хоро: иго промытых детергентом прокладок (примерно посередине), а также на нижние торцы двух из них (боковых). Боковые прокладки накладывают на одно из стекол формы смазкой вниз и к ним вплотную придвигают так же уложенную нижнюю прокладку. Руками (в перчатках) прижимают прокладки к стеклу, следя за тем, чтобы смазка не выдавливалась из-под них в полость формы. На образовавшуюся таким образом П-образную прокладку снова так же наносят сплошной валик смазки по всему периметру и накладывают второе стекло. Всю систему зажимают по трем сторонам пружинными зажимами для бумаг.
При заливке агарозы уплотнение формы можно осуществить Проще — заклеить торцы стекол липкой лентой (лейкопластырем^. Нижнюю прокладку при этом можно не устанавливать. Уплотнение не будет совершенным, но агароза в контакте с прокладками и лентой быстро застынет и заметного ее вытекания не произойдет. Для надежности можно сначала залить небольшой слой агарозы и дать ей застыть в нижней части формы, а потом залить остальной ее объем.
Описано применение в качестве прокладки П-образной полоски силиконовой резины с разрезом, позволяющим отнимать ее нижнюю часть после полимеризации геля. Такая прокладка
йё нуждается в смазке (Stein, Varricchio, 1974]. Можно вместо нижней прокладки сделать в нижней части формы «пробку» из ПААГ повышенной концентрации. Для этого собранные с боковыми прокладками пластины (или пачку пластин) устанавливают в корытце, заполненное раствором мономеров с инициирующими добавками, так, чтобы 'заполнить нижнюю часть формы на высоту 1 см и захватить при этом концы боковых прокладок. Для успешной полимеризации на раствор мономеров наслаивают воду. После полимеризации геля во всем объеме корытца и внутри формы пластины вынимают и лишний ПААГ обрезают. Перед заливкой рабочего геля следует отсосать воду над пробкой и промыть поверхность буфером геля. Фирма «Bio-Rad» предлагает для заливки пластин геля простое устройство, позволяющее с помощью винтов прижать собранные с боковыми прокладками стекла нижними торцами к полоске мягкой резины. Иногда, особенно для гелей толщиной менее 1 мм, нижнее уплотнение осуществляют просто пластилином.
Собранную и уплотненную одним из описанных способов форму устанавливают вертикально и заливают в нее раствор мономеров ПААГ или расплавленную агарозу. Впрочем, ПААГ толщиной 0,4 мм можно заливать в наклонном, а полимеризо-вать — в горизонтальном положении пластин. Это значительно упрощает задачу герметизации формы: достаточно оклеить ее по торцам пластин водостойкой липкой лентой.
В аналитических опытах на каждой пластине обычно ведут электрофорез нескольких препаратов, состав которых можно затем сопоставить при идентичных условиях разделения. Как было локазано на фотографии (см. рис. 3), сопоставляемые препараты фракционируют в параллельных друг другу «треках». В ходе полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд одинаковых углублений прямоугольной формы — «карманов», куда затем и вносят различные препараты. Для этого в еще не заполимеризовавшийся гель или горячую агарозу вставляют «гребенку» из тефлона или плексигласа такой же или чуть меньшей толщины, чем прокладки между стеклами. Прямоугольные зубцы гребенки и формируют карманы для препаратов. На рис.
7 изображена собранная форма с вставленной в гель гребенкой. На боковом сечении можно'видеть, что верхняя часть гребенки немного толще, чем нижняя (с зубцами). Это удобно, так как гребенка ставится каждый раз одинаково и ровно —до упора выступу о торец стеклянной пластины. Кстати, на рис. 7 показаны и прокладки (пунктир). Можно заметить, что нижнюю прокладку делают чуть длиннее ширины стекол, так что ее концы выступают наружу. За эти. концы нижнюю прокладку и вынимают из формы после застывания геля. Для ясности на чертеже показаны только три.Зажима (с правой стороны пластин).
Гель или агарозу заливают между пластинами с таким расчетом, чтобы при опускании гребенки до упора жидкий гель заполнил промежутки между ее зубцами. Гребенку начинают
вставлять с некоторым перекосом, чтобы под ее зубцами не задерживались пузырьки воздуха. Для этой цели торцы зубцов предварительно смачивают, потерев их о стекло с налитым на него раствором акриламида. В тех случаях, когда готовят двухслойный гель, по окончании полимеризации нижнего геля воду отсасывают, поверхности промывают буфером верхнего геля, заливают этот последний и уже в него устанавливают гребенку.
