Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 10. Схема прибора «Мультифор» для электрофореза в горизонтальных пластинах (фирмы LKB)
/ — антиконденсационная крышка;
2 — электродный резервуар; 3 — колодец для внесения препарата; 4 — гель; 5 — фитиль; €охлаждающий столик
Рис. 11. Наложение фитилей на гель в приборе «Мультифор»
/
а
2 Л. А. Остермял
33
Рис. 12. Наложение антиконденсацион- Рис. 13. Внесение препарата в ко-ной крышки лодцы геля
Описанные приборы не предъявляют строгих требований к качеству полимеризации геля у его краев, поскольку края геля не участвуют в электрофорезе. Полимеризацию пластины ПААГ для прибора «Мультифор» ведут в форме, уплотненной по всем четырем краям сплошной резиновой прокладкой. У одного из своих углов она разрезана, и через этот разрез, слегка отогнув прокладку, заливают раствор мономеров в форму. Последняя образована двумя пластинами: стеклянной (толщиной 1 мм) и толстой плексигласовой. На стеклянной пластине гель остается во время электрофореза. Пластину из плексигласа после полимеризации геля снимают; на ней имеется ряд прямоугольных выступов, которые при заливке формируют колодцы для внесения препаратов. Колодцы имеют фиксированный объем (для «Мультифора» — 5 и 10 мкл). В таком же объеме надо вносить и препарат, чтобы он заполнял все сечения геля, но не разливался по его поверхности. Для этого препарат дозируют микрошприцем (рис. 13).
При сборке формы на стеклянную пластину накладывают еще одну толстую пластину из плексигласа и все вместе зажимают пружинными зажимами. Здесь нет необходимости наслаивать воду, да и к материалу уплотнительной прокладки можно не предъявлять высоких требований, поскольку в контакте с ней гель может и не заполимеризоваться. После освобождения геля оставшийся раствор мономеров по его краям можно убрать фильтровальной бумагой. Для облегчения разборки формы ее следует охладить в холодильнике.
Перед использованием ПААГ желательно выдержать не менее 12 ч обернутым в полиэтиленовую пленку во избежание подсыхания, Гели, содержащие додецилсульфат натрия (ДДС-Na),
H j бледуёт Хрднйть § холодильнике, так как ДД6-Ка может выпасть в осадок. При установке пластины с гелем на охлаждающий столик следует налить на него несколько миллилитров раствора детергента, чтобы обеспечить хороший тепловой контакт между столиком и пластиной. До этого имеет смысл провести на столике водонесмываемым фломастером две линии на расстоянии примерно 15—20 мм от каждого из противоположных краев. Эти линии будут видны через гель и пойогут ровно уложить края фитилей, что немаловажно для созданий й геЛё однородного электрического поля.
Следует быстро вносить препараты в колодцы и сразу же начинать электрофорез, так как бромфеноловый краситель склонен диффундировать в геле. В процессе разделения нужно слеДить за тем, чтобы колодцы с оставшимся в них буфером препарата не обсыхали. Это нежелательно, так как искажает распределение тока по сечению геля. В ходе электрофореза можно пополнять колодцы буфером или с самого начала добавить в препарат 10—20% глицерина.
После электрофореза можно хранить гель на том же стекле, обернув его целлофаном, или предварительно перенести на металлическую фольгу. Можно положить на гель фильтровальную бумагу, которая хорошо к нему прилипает, и снять стекло. На этой же бумаге (после фиксации и окрашивания) гель можно и высушить.
Пластины для горизонтального электрофореза в агарозе можно приготовить чрезвычайно просто. На горизонтально установленную (по уровню) плоскость кладут тонкое стекло определенного размера и на него выливают расплавленный раствор агарозы в буфере. Его объем надо рассчитать или подобрать так, чтобы получить пластину нужной толщины. Колодцы для препаратов в этом случае можно и не делать. Фирма LKB рекомендует наносить препараты прямо на поверхность агарозы через прорези наложенного на пластину специального шаблона со щелями. Препарат объемом 2—4 мкл вносят в щель шаблона, откуда он полностью впитывается в агарозу. Впрочем, сравнительно простое приспособление, смонтированное на столике для заливки, позволяет установить над пластиной (перпендикулярно к ее плоскости) гребенку и с ее помощью при. заливке агарозы образовать колодцы для препаратов. Перед использованием пластину агарозы тоже следует выдержать во влажной атмосфере в течение суток.
При электрофорезе нуклеиновых кислот в агарозе используют относительно большие токи, которые могут нагревать фитили из фильтровальной бумаги. Было предложено фитили делать тоже из агарозы — заливкой ее 1—2%-ного раствора в специальные камеры; чописаны конструкции соответствующих приборов [Kaplan et al., 1977; McDonell et al., 1977; Herrick, 1980]. На рис. 14 показан разрез одного из таких простых приборов. В приборе фирмы «Bio-Rad» (модель 1415) фитилями из 0,5%-
35
2*
у
Рис. 14. Прибор для препа-ративного горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле с агарозными фитилями
3
1 — электродные резервуары; 2— форма для заливки агарозы;
3 — съемные перегородки; 4 — гребенка
